胶原蛋白相关基因COL15A1多态性与盆腔器官脱垂的关联研究*

李 蕾，杨 华，朱 兰

(中国医学科学院 北京协和医院 北京协和医院妇产科 国家妇产疾病临床研究中心，北京 100730)

盆腔器官脱垂(pelvic organ prolapse，POP)是由盆底肌肉、结缔组织和神经等所构成的盆底支撑系统功能受损，不能很好地承托盆腔各器官，造成子宫、膀胱、直肠等出现向下移位。尽管POP会影响所有年龄段的女性，但更常见于中老年妇女，极大地影响了女性的生活质量[1]。最新中国成年女性POP流行病学调查数据表明，我国成年女性有症状性POP(≥POP-Q Ⅱ)的患病率为9.56%[2]，绝经后为15%[3]。目前，重度及复发的POP以手术治疗为主，女性经历POP手术的终生风险高达19%[4]，其中30%患者在手术成功后仍需再次手术治疗[5]，是临床上不可忽视并难以解决的问题。目前的证据表明，遗传和环境因素都会导致POP。最常见的环境风险因素包括年龄、体质量指数、胎次和慢性腹内压力增加等，而遗传风险因素则包括种族/民族、POP家族史、马凡综合征或埃勒斯-丹洛斯综合征等[1]。然而，POP的遗传易感性仍有待阐明。

盆底支撑系统对于保持盆腔器官的正常解剖位置至关重要。某些危险因素会影响盆底结缔组织、肌肉和神经的结构和功能，从而引发POP[6]。胶原纤维是结缔组织的主要成分，胶原蛋白的结构、含量和比例的变化可导致盆底结缔组织支撑系统力学性质的变化，从而导致POP的发生和发展[7]。对POP遗传易感性的研究可能有助于识别这种疾病的高危妇女，并以期改进其预防和治疗策略。研究表明，编码胶原蛋白、弹性蛋白和层黏连蛋白等细胞外基质代谢过程的相关基因具有遗传多态性，与POP的发生显著关联[8-9]。本课题组前期工作还筛选了编码胶原蛋白亚基COL3A1、COL1A1、COL18A1、COL14A1和COL5A1等基因作为可能的候选基因[10]，然而COL15A1是否是重度脱垂的潜在候选基因仍未知。本研究中，在中国女性病例对照关联研究中使用Illumina测序平台的目标区域捕获测序的方法对COL15A1基因进行分析，并确定COL15A1中的基因多态性是否与重度POP相关。

1 材料与方法

1.1 样本来源 采用病例对照关联研究，病例组为于北京协和医院就诊且根据盆腔器官脱垂量化系统(POP-Q)分期为Ⅲ度和Ⅳ度脱垂的患者，对照组为无脱垂(0度)和既往无脱垂手术史的患者。参与者均签署知情同意书，研究经北京协和医院伦理委员会批准。排除患有结缔组织疾病，包括马凡综合征、埃勒斯-丹洛斯综合征等，类风湿性关节炎或硬皮病，以及患有神经系统疾病如中风等的妇女。由于不同种族/民族之间的遗传变异不同，所有样本均限于中国汉民族血统。招募48例病例组和48例对照组患者进行基因分型。患者的临床统计学数据在本课题组前期研究中进行了总结[8,10]。

1.2 基因分型和单核苷酸多态性(SNP)选择和分析 从外周静脉全血样品中分离出DNA(Qiagen血液DNA提取试剂盒)，利用安捷伦液体捕获系统(Agilent SureSelect Custom Kit)，使用1～2μg DNA在Illumina HiSeq 4000平台进行双尾末端测序，在每个样品的靶基因区域上提供200×以上的平均覆盖率(北京诺禾致源生物信息科技有限公司)。因此能对COL15A1基因进行综合评估。基于参考基因组(UCSC hg19)的BWA软件将有效的测序数据导入BAM文件。使用Samtools和Picard(http://broadinstitute.github.io/picard)对文件进行排序并标记重复读取。Samtools mpileup和bcftools软件用于调用变体、插入和删除。保留次等位基因频率(MAF)>5%的变异。使用ANNOVAR提供等位基因的位置、类型和保守预测等信息。

1.3 统计学方法 数据分析采用未校正模型和校正模型来研究基因的SNP位点与POP的关系。由于病例组和对照组的妊娠和分娩两个变量不匹配，同时对此多变量模型进行校正。未经校正的模型采用Fisher精确检验，校正模型使用PLINK软件进行logistic回归分析。给出变异位点的比值比(OR)和95%置信区间(CI)。其中OR<1提示该位点变异有保护作用，OR>1时有风险作用。P<0.05被认为是显著的，P<0.1被认为是临界显著的。基因结构示意图显示外显子和内含子及SNP类型，由外显子-内含子图形生成器绘制(http://wormweb.org/exonintron)。使用Haploview软件绘制SNPs间r2的连锁不平衡(LD)图。

2 结 果

2.1 临床数据统计 病例组和对照组的平均年龄[(61.85±10.66)岁 vs (62.73±8.88)岁，P=0.663]和体质量指数[(25.11±3.83)kg/m2vs (24.52±3.48)kg/m2，P=0.434]比较，差异无统计学意义。病例组几乎比对照组多一次分娩(2.35±1.34 vs 1.58±1.06，P=0.005)和妊娠(3.60±1.89 vs 2.50±1.50，P=0.023)次数。因此妊娠和分娩两个变量不匹配，需在分析中进行校正。48例病例组中，41例妇女(85.42%)被诊断为POP-Q Ⅲ期，7例妇女(14.58%)被诊断为POP-Q Ⅳ期[8,10]。

2.2COL15A1基因与POP之间的关联研究 使用Illumina测序平台对COL15A1基因进行测序，共检测出11个SNP位点(图1)。

图1 COL15A1基因结构示意图外显子呈垂直线表示，候选SNP用箭头标记并以不同的颜色表示：外显子(红色)和内含子(蓝色)

在未校正模型和校正模型中，COL15A1的SNP位点rs2297603与POP显著相关(未校正模型：OR=0.44，95%CI为0.21～0.92，P=0.027；校正模型：OR=0.37，95%CI为0.17～0.83，P=0.016)。在校正模型中，rs2075663和rs7854112与POP之间趋向显著相关(OR=1.80，95%CI为0.97～3.35，P=0.062；OR=1.79，95%CI为0.91～3.53，P=0.092)(表1)。其他位点和POP之间无显著相关。

表1 COL15A1基因多态性与POP的相关性

2.3COL15A1基因多态性位点的注释COL15A1基因位于9号染色体q22.33。其中rs2297603是一个错义突变的位点，导致其氨基酸序列上第504位的甘氨酸变成缬氨酸。rs2075663是一个错义突变的位点，导致其氨基酸序列上第204位的甲硫氨酸变成缬氨酸。rs7854112是一个同义突变位点，没有导致氨基酸序列的改变(表2)。

表2 COL15A1基因多态性位点注释

连锁不平衡分析表明,rs35934703与rs3739800之间有较好的连锁不平衡值(r2=0.9)，提示两个位点连锁程度较强。见图2。

图2 COL15A1基因SNP位点的LD分析图每个框中都有r2值，值越接近1.0，两个SNP之间的相关性越高，没有值的框表示完美的LD值(r2=1)

3 讨 论

POP是由于盆底支持组织功能下降导致的一种常见的女性盆底疾病。研究表明，胶原蛋白等细胞外基质主要成分的合成与降解失衡对POP的发病起一定作用，并已开展许多胞外基质相关基因的多态性与POP之间的关联研究[11-12]。本病例对照关联研究中，首次对编码胶原链的COL15A1基因进行了测序。病例组和对照组中，由于分娩和妊娠这两个POP的关键危险因素不匹配，我们分别评估了在未校正模型和校正了分娩和妊娠两个变量的模型中SNPs与POP的相关性，并提供初步的证据表明COL15A1可能是POP的潜在候选基因。

COL15A1编码XV型胶原的α链，XV型胶原在组织中分布广泛，表达最强的部位位于基底膜区，起到将基底膜黏附到下层结缔组织基质的作用[13]。COL15A1作为大纤维胶原的连接体，为胶原基质提供结构完整性。它的特征是一个高度中断的胶原结构域，两侧是大的球状结构域和附着的糖胺聚糖链，因此也被鉴定为硫酸软骨素蛋白多糖[14]。XV型胶原能与基底膜和微纤维成分结合，包括层黏连蛋白、玻连蛋白和纤连蛋白等成分[15]。因此有学者认为其可能在纤维胶原基质和基底膜之间形成一座桥梁，重塑胞外基质，并可能作为“分子减震器”稳定和增强抗压和膨胀的弹性力量[16]。此外，蛋白质水解产生的XV型胶原C末端片段restin，是一种与内皮抑素密切相关的潜在抗血管生成蛋白[17]。

已有研究表明，与对照组相比，POP患者阴道细胞COL15A1表达下降[18]。本研究发现，rs2297603和POP之间存在显著关联，它们可能对POP的发展具有保护作用。rs2297603是一个错义突变，可将氨基酸甘氨酸替换成缬氨酸，这种氨基酸变化可能会引起蛋白质二级结构的变化。错义突变rs2075663和同义突变rs7854112与POP之间存在临界显著关联，它们可能是POP发展的风险因素。然而这些结果还需进一步验证。

本研究的优点：以往的研究限制于某一候选基因的某些特定SNP位点，检测范围非常有限。而本研究采用目标区域捕获测序技术对COL15A1基因进行测序，能检测整个基因及其编码区，系统全面地评估COL15A1基因多态性与POP之间的关联。此外，在这项候选基因研究中，本研究调查了无家族史的散发汉民族群体，从中国大陆招募了严格限制在POP-Q Ⅲ期和Ⅳ期的重度脱垂女性，这些严格的标准增加了发现致病变异的可靠性。

在中国大陆进行的全国性流行病学调查发现，POP-Q Ⅲ期和Ⅳ期的发生率为2.04%[2]，这使得在一定时期内很难招募大量重度脱垂的妇女。本研究样本量相对较小，统计功效可能有限。尽管接受了最小等位基因大于5%的所有变异，但实际上检测出的显著或临近显著的变异的等位基因频率比5%高得多。如果只考虑显著相关的变异(等位基因频率范围为16.67%～58.33%)，这样得出的统计功效在一定程度上可使本研究的数据作为参考。今后需招募更多的女性,在其他与ECM代谢有关的候选基因中进行大规模研究。

综上所述，本研究结果提供了初步的证据表明胶原链编码基因COL15A1的多态性可能与POP有关，今后还需进行更多的验证。