机械力对女性阴道前壁成纤维细胞骨架及凋亡的影响*

李 洋，申复进，洪莎莎，李 维，洪 莉

(武汉大学人民医院妇科，武汉 430000)

压力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)为腹压比最大尿道压力大，且不无膀胱逼尿肌收缩的状态下，不自觉地尿液溢出的现象，其多在运动、咳嗽、打喷嚏等腹压增大情况下发生，是全球中老年妇女常见病[1]，多发生于产褥期年轻妇女及老年妇女。国内外临床数据显示，美国女性尿失禁的患病率高达38%～49.2%，其中50%为SUI[2]，其每年用于治疗尿失禁的费用高达160亿美元，甚至已超过了冠心病单病种在美国的医疗支出[3]；在中国，女性尿失禁患病率约为26.7%，其中SUI占18.6%[4]。在日常生活中，大部分SUI患者需长期使用纸尿裤，可能还会有身体异味的存在，这些都使得他们产生沮丧、自卑、自我隔离的趋向，导致社交障碍，所以SUI又被称为“社交癌”，其严重影响女性的生活质量和身心健康。SUI的发病机制尚不明确，这导致临床诊断、治疗和预防都存在诸多困惑和争议，故在现阶段对SUI发病机制的研究尤为重要。本研究初步探讨机械力对人阴道前壁成纤维细胞骨架及凋亡的影响及其在SUI发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 临床样本 选取2019年3月～2019年12月于武汉大学人民医院妇科行手术治疗的患者17例，其中SUI患者10例(伴前壁脱垂或膀胱膨出，POP-Q Ⅲ～Ⅳ：Ba>+1)，其余7例为因良性肿瘤行子宫全切手术的患者。术中用冷刀切取两类患者手术标本约0.5cm×0.5cm×0.5cm大的阴道前壁组织,4℃保存，并立即安排专人送往实验室进行后续的阴道前壁成纤维细胞原代培养实验。患者均知情同意，并签署知情同意书，本研究经医院伦理委员会审核同意。

1.2 主要仪器与试剂 四点弯曲细胞力学加载系统，流式细胞仪，荧光显微镜(Olympus)，鬼笔环肽(enzo life sciences，美国)，细胞凋亡检测试剂盒(BD Biosciences，美国)，人波形蛋白单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc,美国)，小鼠抗人细胞角蛋白单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc.美国)。

1.3 实验方法

1.3.1 原代阴道成纤维细胞培养 采用改良酶消化法培养原代细胞[5]，主要方法：将阴道前壁组织切成碎片(约1mm3)，置于培养瓶，用I型胶原酶和胰酶消化，再用含100U/mL青霉素和链霉素的10%胎牛血清的DMEM培养基在细胞培养箱中培养，随着时间推移，细胞会逐渐“爬出”，当细胞融合度达到80%时进行传代，本研究使用第3～6代生长良好的成纤维细胞。

1.3.2 细胞机械力加载 采用四点弯曲细胞力学加载系统对成纤维细胞施加机械应变力。该装置由驱动控制单元、加载单元和应变板组成，具体操作可见本课题组前期研究[6]。本研究对非SUI患者阴道前壁原代成纤维细胞进行力学加载，力学参数设置为2666με(加载位移为2mm)，频率为0.1Hz，持续4h。

1.3.3 原代成纤维细胞鉴定 原代成纤维细胞呈长梭形，免疫组化染色显示波形蛋白阳性，角蛋白阴性。本研究使用第3～6代稳定的原代成纤维细胞，在室载玻片中培养至50%融合度，随后洗涤、固定，用0.4% Triton X-100处理。用3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性。小鼠抗人波形蛋白单克隆抗体(200μg/mL)和小鼠抗人细胞角蛋白单克隆抗体(200μg/mL)孵育细胞，4℃过夜；用PBS代替一抗作为阴性对照。二抗孵育，用苏木精染核。最后，用荧光显微镜观察并拍照。

1.3.4 鬼笔环肽染色 用PBS冲洗各组成纤维细胞，4%多聚甲醛室温下固定细胞15min，用0.4% Triton X-100处理5min，再用FITC结合的鬼笔环肽在4℃下孵育各组成纤维细胞，过夜。次日用DAPI染细胞核，最后用荧光显微镜观察鬼笔环肽染色的细胞面积，并用软件Image-Pro Plus 6.0定量分析阳性表达区域的面积。

1.3.5 细胞凋亡检测 各组原代成纤维细胞用胰蛋白酶消化，PBS洗涤3次后收集。用100μL结合缓冲液(Binding buffer)重新悬浮成纤维细胞。根据细胞凋亡检测试剂盒说明书把5μL的PE Annexin V和5μL的7-AAD添加到每组细胞中，轻柔混合，室温避光孵育15min,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2 结 果

2.1 患者临床参数分析 3组患者的年龄、阴道分娩次数、体质量指数(body mass index,BMI)比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 三组样本临床资料参数分析

2.2 成纤维细胞鉴定 免疫组化染色显示,原代培养的细胞波形蛋白阳性，角蛋白阴性。光学显微镜下观察见细胞呈长梭形，符合成纤维细胞特点(图1)。

图1 原代成纤维细胞鉴定A～C：细胞荧光染色；D：原代培养成纤维细胞白片

2.3 细胞骨架染色 鬼笔环肽可使actin细胞骨架特异性染色，本研究中用于原代成纤维细胞的actin细胞骨架的染色，表示细胞骨架完整性，染色面积越小表明细胞骨架破坏程度越大。本研究结果显示，与正常成纤维细胞相比，机械力加载的正常成纤维细胞的细胞骨架着色显著减少(P<0.001)，表明细胞骨架受到破坏；并且SUI组的成纤维细胞着色显著减少(P<0.001)，见图2。

图2 三组细胞细胞骨架检测***P<0.001 vs CON组

2.4 细胞凋亡 与CON组成纤维细胞相比，机械力加载后的CMS组细胞的早期凋亡和晚期凋亡的总体凋亡率显著升高(P<0.001)；CMS组的凋亡率呈现出与SUI类似的变化，见图3。

图3 细胞凋亡率检测***P<0.001 vs CON组

2.5 细胞骨架与细胞凋亡相关性分析 SUI组和CMS组中细胞的凋亡率升高，细胞骨架明显受到破坏，且与CON组相比具有显著差异。相关性分析显示，SUI组和CMS组中细胞凋亡率和细胞骨架的完整性呈负相关(r=-0.8484，P=0.0158；r=-0.8964，P=0.0004)，见图4。

图4 细胞凋亡率和细胞骨架的相关性分析

3 讨 论

SUI发生的病理生理机制至今尚未完全阐明。从解剖学水平分析，导致SUI发病的关键机制在于尿道支持功能减弱和尿道固有括约肌功能缺陷。盆底肌肉、韧带及筋膜组织共同为尿道提供支持作用，筋膜和韧带通过维持膀胱颈和尿道的位置及尿道的闭合以实现尿自禁功能。目前主流观点认为，盆底支持结构松弛可导致SUI。大量临床流行病学研究揭示[7-8]，年龄、妊娠、分娩、便秘、肥胖等均是SUI的致病因素。除了衰老引起盆底支持结构退行性病变外，妊娠、便秘、肥胖可引起盆腹腔压力增加导致的盆腔组织所受的机械力异常增高，引起盆腔机械损伤，从而产生慢性机械力作用效应，最终提高了SUI的发病风险，而分娩则是急性机械力损伤的过程。当腹部压力的间歇性或持续性增加超过盆底肌肉收缩所产生的张力时，就会出现疼痛、器官脱垂和SUI等症状和疾病[9]。因此，从宏观层面上分析，盆底支持结构经受的机械力损伤可能是导致SUI发生的重要因素。

女性盆底组织受到各种力量的影响，包括重力、怀孕、分娩、咳嗽、排便和其他力量。健康成人平卧位腹压在5～7mmHg(1mmHg=0.133kpa)之间，站立、日常活动、体力劳动和举重运动时腹压增大。而POP患者骨盆底支撑组织中细胞的生物力学特性已被证实是异常的，提示POP是一种由骨盆底支撑组织生物力学特性进行性下降引起的疾病[10]。细胞骨架重构是细胞相应机械力刺激的关键过程[11-12]。actin细胞骨架是由微丝组成的动态变化的结构，决定了细胞的形态和强度，在抵抗机械拉力方面起着重要作用[13]。最重要的是，细胞骨架重组促进细胞外信号的传递，导致基因转录，改变细胞周期和细胞形态[14]。女性盆底组织处于妊娠、分娩等腹压变化的复杂生物力学环境中，盆底肌肉、韧带产生的力平衡状态是维持其正常结构功能的基础。故目前对于SUI发病的研究认为，其发病的关键因素主要与盆底肌肉、韧带及筋膜等支持结构松弛密切相关[15]，而成纤维细胞则是盆底韧带的重要组成部分。Kokcu等[16]研究发现，盆底松弛的患者成纤维细胞数量较非脱垂患者显著减少。既往实验也表明，损伤性机械力可明显抑制成纤维细胞增殖[17]，由此可见，盆底成纤维细胞数量减少是导致SUI发病的重要原因。此外，大量国内外研究也表明SUI的发病与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的重构有着密切关系[18-19]，而ECM的主要成分如胶原和细胞因子[20]等分泌与盆底成纤维细胞有着密不可分的联系。由此可见，成纤维细胞的数量和功能在SUI发病中有着重要作用，成纤维细胞凋亡率增加势必促进SUI发生发展的进程。

本研究中，机械力加载正常成纤维细胞后不但破坏了成纤维细胞的actin细胞骨架，还引起了显著的细胞凋亡，呈现出与SUI患者成纤维细胞类似的特点，这在一定程度上说明了成纤维细胞的actin细胞骨架的破坏和细胞凋亡可能均参与了SUI的发生发展。并且经分析发现，SUI患者成纤维细胞或机械力加载后的正常成纤维细胞的actin细胞骨架的破坏程度与细胞凋亡呈正相关。这也在某种程度上说明了actin细胞骨架和细胞凋亡在SUI的发生发展中存在一定的联系。此外，有报道证实actin细胞骨架传统上被认为是凋亡开始时高度动态的细胞骨架元素[21]，细胞骨架的一些重要变化参与了细胞凋亡过程及相关信号的传递[22]。

SUI发病机制的阐明有助于我们更好地实施预防、诊断和治疗措施，具有重要的现实意义。盆底功能障碍性疾病(pelvic floor dysfunction,PFD)的发病机制复杂，本团队前期已在多个角度对其进行了探究，如氧化应激、ECM等。本研究初步探讨了actin细胞骨架和细胞凋亡在SUI发病中的作用，及两者可能存在的关系，这些可能都参与了其发生发展，但具体作用方式还需进一步研究。