桃仁红花煎对妊娠期糖尿病大鼠及其子代结局的影响与机制

张阳，李学春，李莉

长沙市第四医院妇产科，长沙410006

调查显示，我国妊娠期糖尿病（GDM）发病率逐年升高［1］。GDM 患者血糖与子代结局不良相关，高血糖能够增加胎儿病死率、新生儿过度生长及先天性异常发生率。因此，对GDM 患者进行血糖控制对改善子代结局具有重要意义［2］。胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2（IGF2BP2）是胰岛素样生长因子家族成员之一，可通过IGF 依赖或非依赖发挥生物学作用［3］。IGF2BP2 是糖尿病发生的易感基因，能够加快胰岛β 细胞损伤，促进糖脂代谢紊乱［4］。GDM 的治疗以药物干预为主，中药治疗GDM 具有较高的安全性。桃仁红花煎最初记载于《素庵医案》，有活血、祛瘀、通经舒络等作用。桃仁红花煎治疗糖尿病肾病疗效较好，其主要通过抑制Wnt/βcatenin 信号激活而发挥作用［5］。但桃仁红花煎对GDM 的治疗鲜见研究报道。2020年9月—2021年4月，本研究通过建立GDM 大鼠模型观察桃仁红花煎对GDM大鼠子代结局的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 40只SPF级SD雌性大鼠、80 只SPF 级SD 雄性大鼠均购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，体质量200～300 g，许可证号：SCXK（浙）2019-0001，湿度为55%，温度25 ℃，模拟黑白交替无菌饮食2 周，定时清洗、消毒鼠笼，符合《实验动物管理条例》。链脲佐菌素（STZ）购自北京中生瑞泰科技有限公司；桃仁红花煎组方：桃仁9 g、红花9 g、川芎 9 g、丹参9 g、香附9 g、延胡索9 g，生地12 g、青皮12 g、当归12 g、赤芍12 g，水煎至每毫升含药5 g；盐酸二甲双胍片购自华北制药股份有限公司；小鼠抗人IGF2BP2 单克隆抗体、核转录因子κB（NF-κB）抗体均购自卡迈舒（上海）生物科技有限公司；HE 试剂盒购自西安永屹生物技术有限公司；FlexiWash 全自动蛋白质免疫印迹系统够自环亚生物科技有限公司。

1.2 动物分组及GDM 模型构建 按照随机数字表法将40只雌性大鼠分为A、B、C、D 组各10只。大鼠动情期将雌性与雄性大鼠按1∶2 合笼，次日清晨采用阴道涂片法检测雌性大鼠阴道存在精子则确定为妊娠［6］。妊娠第5天，B、C、D 组在尾静脉注射STZ 混悬液35 mg/kg，72 h 后检测空腹血糖（FPG），FPG≥13.5 mmol/L 为GDM 模型制备成功，造模成功大鼠共30只。A组大鼠尾部注射等体积枸橼酸—磷酸氢二钠缓冲液。最终四组各有9只大鼠符合实验。

1.3 药物干预 C 组于建模后当日用桃仁红花煎10 g/kg灌胃，D组采用二甲双胍200 mg/kg灌胃，A、B组给予等体积生理盐水灌胃，每日1次，共给药19 d。

1.4 FPG 及胰岛素检测 分别于孕前及孕7、19 d采集各组大鼠尾静脉血1.5 mL，用血糖仪检测FPG，用酶联免疫吸附法检测胰岛素。

1.5 胎鼠胚胎存活数及体质量统计 孕19 d用2%戊巴比妥（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，开腹取出胚胎并分离胚胎，计算各组胚胎存活数，称取胎鼠出生体质量。用生理盐水冲洗胎盘组织，将其放入-80 ℃冰箱中保存待用。

1.6 胎盘组织病理变化观察 采用HE 染色。胎盘组织经石蜡包埋后制5 μm 厚切片，脱蜡10 min后，用95%乙醇水化，用碱性苏木精染色15 min，PBS 冲洗3 次，蒸馏水清洗，用1%伊红复制液染色3 min，PBS 透明，在200倍显微镜下观察胎盘组织病理改变。

1.7 胎盘组织中 IGF2BP2、NF-κB mRNA 表达检测 采用qRT-PCR。将胎盘组织加入0.125%胰蛋白酶裂解，用TRIzol 法提取总RNA，无核酸酶溶解。按照MicroRNA 反转录试剂盒说明书对总RNA 进行反转录。反转录体系20 μL：总RNA 1 μL，5×Reaction Mix 4 μL，10 × Super Script Enzyme Mix 2 μL，加入双蒸水将体系补足至20 μL。反应条件：42 ℃作用60 min，72 ℃作用5 min，4 ℃保存。用qRT-PCR进行检测，上下游引物均为0.5 μL，以β-actin 为内参，反应条件：95 ℃预作用3 min，95 ℃作用5 s、58 ℃退火，以上40 个循环，72 ℃延伸10 min，于4 ℃保存。用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。IGF2BP2上游引物序列5'-AACAGGACTGTCCGTGCTAT-3'，下游引 物 序 列 5'-CTCTGGATAACAGTGATGAT-3'；NF-κB 上游引物序列 5'-CTGAACCAGGGCATACCTGT-3'，下游引物序列5'-GAGAAGTCCATGTCCGCAAT-3'；β-actin 上游引物序列 5'-TCACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下游引物序列5'-CTGGAAGGTGGACACCGAGG-3'。

1.8 胎盘组织IGF2BP2 及NF-κB 蛋白表达检测采用Western blotting 法。取胎盘组织加入胰蛋白裂解液，4 ℃下以12 000 r/min 离心15 min 后收集上清液，以BCA 蛋白定量试剂盒测定总蛋白含量。取蛋白30 μg，与上样缓冲液混合后，行十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳，并于电泳后转移至硝酸纤维素酶膜上，以5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入IGF2BP2（1∶500）及 NF-κB（1∶500）一抗、GAPDH（1∶1 000），于4 ℃孵育过夜；用TBST溶液清洗10 min×3次，加入抗兔IgG 二抗（1∶1 000），室温孵育1 h，用TBST溶液清洗10 min×3次，以ECL化学发光试剂显色后置于蛋白电泳系统及凝胶成像仪上成像，使用Image J 软件处理，以 IGF2BP2、NF-κB 与内参 GAPDH 条带灰度值的比值作为 IGF2BP2、NF-κB 蛋白的相对表达量。

1.9 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。符合正态分布的计量资料用表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组不同时间FPG 及胰岛素水平比较 见表1。

表1 各组不同时间FPG及胰岛素水平比较（）

表1 各组不同时间FPG及胰岛素水平比较（）

注：与同期A组比较，*P＜0.05；与同期B组比较，#P＜0.05。

胰岛素（mIU/L）组别A组B组C组D组孕19 d 12.03±3.84 24.63±3.35*17.20±3.25*#16.93±3.45*#n 9 9 9 9 FPG（mmoL/L）孕前5.41±0.90 5.52±0.81 5.47±0.83 5.50±0.79孕7 d 5.80±1.21 16.33±2.65*14.30±1.51*#13.66±1.47*#孕19 d 6.05±1.10 20.89±3.14*10.25±1.18*#10.69±1.30*#孕前11.24±4.30 11.56±4.22 11.60±4.15 11.33±4.51孕7 d 11.33±3.98 21.28±3.60*19.31±3.02*#18.48±3.22*#

2.2 各组胎鼠胚胎存活数和体质量 见表2。

表2 各组胎鼠胚胎存活数和体质量比较（）

表2 各组胎鼠胚胎存活数和体质量比较（）

注：与A组比较，*P＜0.05；与B组比较，#P＜0.05。

组别A组B组C组D组n 9 9 9 9胚胎存活数（只）18.5±1.2 13.2±2.0*15.5±2.3*#16.4±1.6*#出生体质量（g）1.75±0.06 2.15±0.05*1.83±0.04*#1.81±0.05*#

2.3 各组胎盘组织病理变化比较 A 组胎盘组织中纤维、滋养叶及血窦层均结构清晰分明；B 组胎盘组织分层模糊，存在细胞间隙增大，细胞布局紊乱；C 组、D 组胎盘组织分布逐渐清晰，间隙缩小，细胞整齐。

2.4 各组胎盘组织中 IGF2BP2、NF-κB 表达比较见表3。

表3 各组胎盘组织中IGF2BP2、NF-κB表达比较（）

表3 各组胎盘组织中IGF2BP2、NF-κB表达比较（）

注：与A组比较，*P＜0.05；与B组比较，#P＜0.05。

组别n 9 9 9 9 A组B组C组D组IGF2BP2 mRNA 1.00±0.00 1.89±0.18*1.33±0.14*#1.30±0.09*#蛋白1.33±0.15 3.28±1.05*2.01±0.82*#1.96±0.90*#蛋白0.65±0.04 2.30±0.58*1.57±0.20*#1.49±0.31*#NF-κB mRNA 1.00±0.00 2.16±0.65*1.69±0.28*#1.56±0.33*#

3 讨论

中医认为糖尿病的产生与脏腑功能失调、脾气虚弱等因素相关。孕后饮食不节，血气失调，冲任损伤，脾失健运，胎水肿满等均会导致GDM［7］。中医药治疗糖尿病已有几千年历史。《诸病源候论》认为GDM 产生与机体“胎间水气，子满体肿者，脾胃虚弱，脏腑之间有停水”有关，故应采用气阴双补、脾肾兼治的治疗方法。GDM 与糖尿病的发病机制存在一致性，均表现为糖脂代谢紊乱、血糖升高能及机体胰岛素抵抗能力异常［8］。GDM 患者存在胰岛β细胞增生，可损伤胰岛素功能，抑制胰岛素水平，促使血糖升高［9］。临床治疗GDM 以药物为主，西医降糖药物主要是二甲双胍类药物，但其会渗透到胎盘，影响胎儿发育［10］。

桃仁红花煎由桃仁、红花、当归、香附、延胡索、赤芍、川芎、丹参、青皮、生地黄十味药物组成。以桃仁、红花为君药，可通络行气、活血化瘀；以延胡索、川芎、丹参等为臣药滋阴养血［11］。桃仁配伍红花活血祛瘀效果强，延胡索为辛散温通药物，与桃仁合用能够改善气滞。川芎行气，生地养阴，二者配伍调和阴阳。诸药合用有活血化瘀、行气之功效。桃仁红花煎中桃仁、红花为黄酮类物质能够改善微循环，发挥抗炎、改善胰岛素抵抗等作用［12］。GDM 大鼠存在高胰岛素等症状，影响胎鼠的结局，主要表现为胚胎存活数减少、胎鼠出生体质量增加［13］。高糖能够增加子代胎鼠糖脂代谢，导致脂肪堆积、幼鼠出生体质增加，进而降低生存率［14］。研究表示，桃仁抗炎解毒，促进子宫内残留组织排出。川芎、红花能够通过促进胰岛素分泌，分解糖分降低血糖，降低子代胎鼠体质量及病死率［15-16］。本研究结果显示，C 组及 D 组FPG 及胰岛素水平降低，说明桃仁红花煎具有调节糖代谢的作用。

IGF2BP2 广泛存在于人体多个组织器官中，具有刺激胰岛素分泌的作用。研究证实，IGF2BP2 与糖尿病发生发展密切相关，参与胰岛β 细胞功能损伤，增加胰岛素抵抗，进而促进糖脂代谢紊乱［17-18］。在 GDM 中 IGF2BP2 表达升高，是 GDM 发生的易感基因。NF-κB 激活能够促进糖尿病发生发展。NF-κB 作为原始信号能够导致细胞紊乱及损伤。陈秦莉等［19］研究证实，GDM 患者外周血中 NF-κB 表达升高能够激活大量炎症介质，促进胰岛素抵抗。本研究结果表示，桃仁红花煎能够通过抑制IGF2BP2 及NF-κB 表达而降低GDM 大鼠的血糖。这与林峰等［20］研究结果相似，但是桃仁红花煎抑制IGF2BP2及NF-κB表达的机制尚不清楚，需进一步研究。

综上所述，桃仁红花煎能够降低GDM 大鼠血糖及胰岛素水平，提高其子代胚胎成活率，改善胎盘组织病理，其作用机制可能与抑制IGF2BP2 及NF-κB信号通路激活有关。本研究也存在不足，由于时间及成本影响样本受限，干预时间及干预次数还需完善，在今后的研究中可增加更多实验方法为GDM 的治疗提供实验依据。