RNA干扰COMMD8基因表达下调PI3K/AKT信号通路诱导肺癌凋亡和增加顺铂敏感性

杨颖 汪锐 成薇婷

(武汉市第一医院肿瘤科一病区，湖北 武汉 430000)

肺癌是世界上发病率和死亡率最高的癌症之一，每年大约180万人被诊断为肺癌，160万人死于肺癌，患者5年生存期为4%～17%〔1〕。非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的85%，靶向治疗是其主要的治疗方式，但患者逐渐显现的耐药性是临床治疗的主要障碍〔2〕。研究肺癌发展的分子机制，为其提供新的治疗靶点或抑制剂可有效改善患者生存期。研究表明，铜代谢MURR1结构域(COMMD)8在NSCLC中高表达，参与LINC00657靶向miR-26b-5p/COMMD8信号通路，可促进NSCLC的进展〔3〕，但其具体作用机制尚未明确。COMMD8在肝癌中也表达上调，促进肝癌细胞的增殖和侵袭〔4〕。本课题以肺癌细胞H1299为主要研究对象，假设转染si-COMMD8可抑制肺癌增殖、迁移和侵袭和促进凋亡，增强其顺铂敏感性，并对此假设进行验证，以期为肺癌治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1材料 人正常肺上皮细胞株BEAS-2B和人肺癌细胞株H1299、SPC-A-1、H446购自ATCC；胎牛血清(FBS)购自美国Hyclone公司；DMEM高糖培养基和RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；PI3K/Akt信号通路通路激动剂胰岛素样生长因子(IGF)-1(HPLC≥98%)购自上海联硕生物科技有限公司；顺铂(DDP)购自上海源叶生物科技有限公司，胰蛋白酶购自美国Sigma-Aldrich公司；COMMD8 RNA干扰剂(si-COMMD8)和阴性对照si-con购自上海吉玛制药有限公司；Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；RNA提取试剂Trizol、 实时荧光聚合酶链反应(PCR)试剂盒、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；COMMD8抗体、Ki-67抗体、基质金属蛋白酶(MMP)-2抗体、多药耐药基因(MDR)1抗体、酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3抗体、p-PI3K抗体、p-AKT抗体和β-actin抗体购自英国Abcam公司；CCK-8试剂盒及二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；细胞凋亡检测试剂盒及流式细胞仪购自美国BD公司，实时荧光PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将人正常肺上皮细胞株BEAS-2B培养在含10%FBS的DMEM高糖培养液中，将肺癌细胞H1299、SPC-A-1和H446培养在含10 % FBS的RPMI1640培养基中，培养液中均添加100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素，将细胞置于37℃、5%CO2培养箱中培养，洗涤消化传代。

1.2.2Real-time PCR检测COMMD8 mRNA的表达 收集培养好的BEAS-2B、H1299、SPC-A-1和H446细胞，用Trizol试剂提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，检测cDNA的浓度和纯度，置于-80℃保存。以cDNA为模板按照实时荧光PCR的说明书进行反应，合成COMMD8 mRNA。引物如下：COMMD8上游引物：5′-TGTGGTCGAGCTTATCCTGTG-3′，下游： 5′-GTGCAAGCTTTACCTGCCAA-3′。运用2-ΔΔCt方法进行数据分析。

1.2.3Western印迹检测蛋白表达 收集培养好的BEAS-2B、H1299、SPC-A-1和H446细胞，或转染si-COMMD8后的H1299细胞，裂解细胞，收集细胞总蛋白，收集蛋白并用BCA法检测蛋白浓度。然后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜，室温封闭2 h，加入稀释的一抗(COMMD8抗体1∶1 000、Ki-67抗体1∶1 000、MMP-2抗体1∶3 000、MDR1抗体1∶1 000、酶切caspase-3抗体1∶2 000、p-PI3K抗体1∶1 000、p-AKT抗体1∶1 000和β-actin抗体1∶3 000)，4℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)缓冲液洗膜3次，然后加入稀释的辣根过氧化物酶标二抗，室温孵育2 h，显色，拍照。以β-actin为内参照，分析蛋白相对表达水平。

1.2.4细胞转染 将H1299细胞接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到70%时，按照转染试剂说明书进行转染si-COMMD8，以转染si-con为对照。转染分组：空白(NC)组(不转染)，对照(转染si-con)组和si-COMMD8(转染si-COMMD8)组。si-COMMD8试验组(转染si-COMMD8的H1299细胞)、si-COMMD8+IGF-1(转染si-COMMD8后用100 ng/ml IGF-1培养48 h)、si-COMMD8+PBS(转染si-COMMD8加入与IGF-1等量的PBS进行培养48 h)，转染48 h后收集细胞进行验证。转染成功后用100 ng/ml P13K/Akt信号通路激动剂IGF-1培养细胞48 h。

1.2.5Western印迹检测蛋白表达 收集转染si-COMMD8 后的H1299细胞，将细胞洗涤2次，加入RIPA裂解液重悬细胞，室温裂解细胞20 min，冰浴超声破碎细胞，收集蛋白并用二喹啉甲酸(BCA)法检测蛋白浓度。每个样本取30 μg蛋白进行SDS-PAGE，转膜，室温封闭2 h，加入稀释的一抗〔COMMD8抗体1∶1 000、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2抗体1∶3 000、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体1∶2 000和β-actin抗体1∶4 000〕，4℃孵育过夜，洗膜3次后加入稀释的辣根过氧化物酶标二抗，室温孵育2 h，显色，拍照。以β-actin为内参照，分析蛋白表达水平。

1.2.6CCK-8实验检测细胞存活率 将转染后或(和)IGF-1处理过的H1299细胞培养至对数生长期，消化后将细胞稀释为2×104个/ml，以2×103个/孔(100 μl细胞)接种于96微孔板中，加入10 μl CCK-8液体，将各组细胞继续培养2 h，酶标仪检测450 nm 处的吸光度(A)值。细胞存活率%=试验组A值/对照组A值%。

1.2.7Transwell实验检测迁移和侵袭数 迁移实验：将1.2.5分组的各组H1299细胞培养至对数生长期，收集并消化细胞，用无血清培养液将细胞稀释为1×106个/ml，Transwell上层小室中加入100 μl细胞，,下层培养孔加入500 μl含10%FBS的培养基，培养24 h，取出用棉签拭去上层小室内层未迁移的细胞，冰甲醛固定细胞，结晶紫染色，然后显微镜取5个视野计数迁移细胞，取平均值。

侵袭实验：将液化的基质胶以1∶4比例用4℃无血清培养基稀释，稀释后取100 μl加入上层Transwell小室，使其平铺入上层小室，37℃放置3～5 h使其固态化，以下步骤同迁移实验，上层加入100 μl细胞，下层加入无血清培养基，培养24 h，固定细胞，染色，计数侵袭细胞。

1.2.8流式细胞术测定细胞凋亡率 将1.2.5分组的各组H1299细胞收集并进行消化，取2×104个细胞置于离心管内，根据凋亡试剂盒的说明用200 μl结合缓冲液重悬细胞，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，室温避光10～20 min，上流式细胞仪测定细胞凋亡率。

1.3统计学处理 采用SPSS19.0软件进行t检验和单因素方差分析。

2 结 果

2.1COMMD8基因在人正常肺上皮细胞株和肺癌细胞中的表达 肺癌H446、SPC-A-1和H1299细胞中COMMD8 mRNA和蛋白水平均显著高于BEAS-2B组(均P<0.05)，见图1和表1。选取表达差异较大的H1299细胞进行后续实验。

表1 检测人正常肺上皮细胞株和肺癌细胞中COMMD8 mRNA和蛋白的表达

2.2沉默COMMD8基因抑制细胞存活和细胞迁移侵袭 NC组和si-con组COMMD8、Ki-67、MMP-2、细胞存活率、迁移细胞数、侵袭细胞数差异无统计学意义(均P>0.05)。与si-con组和NC组相比，si-COMMD8组COMMD8、Ki-67和MMP-2蛋白含量均

显著降低(P<0.05)，细胞存活率显著降低，迁移和侵袭细胞数均显著降低(P<0.05)，见图2和表2。说明沉默COMMD8可抑制Ki-67和MMP-2蛋白表达，抑制H1299细胞存活、迁移和侵袭。

1～4：BEAS-2B组，SPC-A-1组，SPC-A-1组，H1299组图1 Western印迹检测人正常肺上皮细胞株和肺癌细胞中COMMD8蛋白的表达

表2 沉默COMMD8基因抑制细胞存活和细胞迁移侵袭及Ki-67、MMP-2蛋白的表达

2.3沉默COMMD8基因诱导增加DDP敏感性 NC组和si-con组酶切caspase-3、MDR1、DDP及凋亡率差异均无统计学意义(均P>0.05)。与si-con组和NC组相比，si-COMMD8组酶切caspase-3含量显著升高(P<0.05)，MDR1蛋白含量显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，DDP对H1299的IC50值显著降低(P<0.05)，见图3，图4，表3。说明沉默COMMD8可诱导H1299细胞凋亡并增加细胞的DDP敏感性。

1～3：NC组，si-con组,si-COMMD8组图3 Western印迹检测酶切caspase-3和MDR1蛋白的表达

表3 沉默COMMD8基因对凋亡、DDP敏感性及酶切caspase-3、MDR1蛋白表达的影响

2.4沉默COMMD8基因影响PI3K/AKT信号通路 NC组和si-con组p-PI3K和p-Akt蛋白差异无统计学意义(P>0.05)。与si-con组和NC组相比，si-COMMD8组p-PI3K和p-AKT蛋白含量均显著降低(P<0.05)，见图5和表4。说明沉默COMMD8可抑制H1299细胞中的PI3K/AKT信号通路。

图5 Western印迹检测p-PI3K和p-AKT蛋白的表达

表4 沉默COMMD8基因抑制PI3K/AKT信号通路

2.5IGF-1部分逆转沉默COMMD8基因对肺癌细胞P13K/Akt信号通路、增殖和迁移侵袭的影响 与si-COMMD8+PBS组相比，si-COMMD8+IGF-1组，p-PI3K和p-AKT含量均显著升高(P<0.05)，COMMD8、Ki-67和MMP-2蛋白的表达量均显著升高(P<0.05)，细胞存活率、迁移细胞数和侵袭细胞数均显著升高(P<0.05)，见图6和表5。说明IGF-1可逆转沉默COMMD8对H1299细胞PI3K/AKT信号通路、增殖和迁移侵袭的影响。

1，2：si-COMMD8+PBS组,si-COMMD8+IGF-1组图6 Western印迹检测COMMD8、Ki-67、MMP-2、p-PI3K和p-AKT蛋白的表达

表5 IGF-1可逆转沉默COMMD8基因对肺癌细胞PI3K/AKT信号通路及增殖和迁移侵袭的影响

2.6IGF-1部分逆转沉默COMMD8基因对P13K/Akt信号通路、增殖和迁移侵袭的影响 与si-COMMD8+PBS组相比，si-COMMD8+IGF-1组酶切caspase-3含量显著降低(P<0.05)，MDR1蛋白含量显著升高(P<0.05)，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，DDP对H1299的IC50值显著升高(P<0.05)，见图7，图8，表6。说明IGF-1可逆转沉默COMMD8对H1299细胞凋亡和DDP敏感性的影响。

表6 IGF-1可逆转沉默COMMD8基因对凋亡和DDP敏感性的影响

图8 流式细胞术检测同时沉默IGF-1和COMMD8后肺癌细胞凋亡

1，2：si-COMMD8+PBS组，si-COMMD8+IGF-1组图7 Western印迹检测酶切caspase-3和MDR1蛋白的表达

3 讨 论

COMMD8是COMMD家族成员之一，COMMD家族的10个成员(COMMD1～COMMD10)在细胞内转运和转录调控中发挥关键作用，含有一个70～80个氨基酸的高度保守的C末端序列，称为COMM结构域；COMMD家族成员在人多种组织中广泛表达，可能参与铜的代谢，它们彼此形成低聚物复合物，该复合物定位于体内隔室并介导几个跨膜货物的运输〔5〕，COMMD蛋白可能通过促进核因子(NF)-κB亚基与连接酶的结合参与泛素化途径，在细胞内环境稳定中发挥更广泛的作用〔6〕。COMMD蛋白在血浆脂蛋白水平和动脉粥样硬化的形成中也发挥重要作用〔7〕，而其表达失调也与多种疾病和癌症的发生和发展有关。研究表明，COMMD8在NSCLC中表达上调，LncRNA LINC00657通过靶向miR-26b-5p/COMMD8 促进肺癌的进展〔3〕，说明COMMD8在肺癌的发展中具有重要作用，可能是肺癌的潜在分子靶点。

NSCLC患者通常发生基因突变和癌基因的过度表达，利用突变基因和癌基因的siRNA进行靶向治疗是近年来出现的一种新的肿瘤治疗策略，它通过特异性靶向抑制与肿瘤发生和转移相关的基因来实现对癌症的抑制作用〔8〕。Mao等〔9〕研究表明，在肺癌A549和H460细胞中转染siRNA-TMEM98能有效抑制A549和H460细胞的增殖、侵袭和迁移，细胞中MMP-2、MMP-9、RhoC和MTA1均受到显著调节。He等〔10〕研究发现，肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)6在人肺癌细胞中表达上调，siRNA诱导的人肺癌SPC-A1细胞中TRAF6基因敲除可抑制癌细胞侵袭，促进细胞凋亡。研究还发现，动粒相关蛋白(KNTC)2在肿瘤中表达上调，包裹在脂质纳米粒(KNTC2-LNP)中KNTC2 siRNA在原位肝细胞癌异种移植小鼠模型体内具有抗肿瘤活性，在肺癌异种移植瘤皮下模型中也具有抗肿瘤活性，抑制肿瘤生长〔11〕。本研究结果说明在肺癌H1299细胞中RNA干扰COMMD8具有抑制肺癌提高DDP敏感性的作用。

PI3K/AKT信号通路调节多种细胞功能，包括细胞生长、分化、增殖、存活、运动、侵袭和细胞内转运等，此通路调控的失调与多种癌症的发生和进展有关，也与NSCLC患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗的抵抗和较低的生存率有关〔12〕。PI3K/AKT/mTOR通路在癌症中通常是异常激活状态，是携带EGFR激活突变的肺腺癌患者获得性抵抗EGFR-TK抑制剂的机制之一，PI3K通路的几种抑制剂正在临床前和临床研究中进行评估〔13〕。PI3K抑制剂的早期临床研究已经证明了初步的抗肿瘤活性和可接受的安全性〔14〕；靶向AKT也是肿瘤靶向治疗的一个有效途径〔15〕。本研究结果说明转染si-COMMD8 可抑制PI3K/AKT信号通路；进一步研究发现，PI3K/AKT信号通路激动剂IGF-1处理可逆转沉默COMMD8对H1299细胞PI3K/AKT信号通路、增殖、迁移、侵袭、凋亡及DDP敏感性的影响。