米曲霉和黑曲霉协同发酵杏仁粕风味物质的变化

零春甜，汤辉煌，周彩莹，杨 晨，汪建明

(天津科技大学食品科学与工程学院，天津 300457)

苦杏仁俗称山杏仁，是世界上最流行的坚果之一[1].杏仁粕是杏仁油提取后的副产物，蛋白质含量丰富，占杏仁粕的50%以上.采用微生物发酵杏仁粕，不仅可以将蛋白质降解为多肽和氨基酸等物质，还可以产生具有杏仁粕曲料特征的风味.黑曲霉是一种广泛运用于食品发酵的真菌，用来发酵杏仁粕不会产生真菌毒素，符合食品卫生的要求[2].米曲霉是一种生长快、酶系丰富、不产毒素的菌种，目前广泛应用于调味品的生产[3].

近年来，利用微生物发酵改良食品风味已有较多报道.周彩莹等[4]在最佳工艺条件下用黑曲霉发酵亚麻籽粕，测得氨基态氮含量为1.92%时产生风味的香气浓郁.左勇等[5]研究发现发酵甜面酱的氨基态氮含量为13.78～16.6mg/g时，对鲜味有重要贡献.任利平等[6]利用发酵酶解法优化干腌火腿风味基料氨基态氮含量为2.25%，风味评分最高.混菌发酵产生的酶系比单一菌种复杂，可显著改良食品的风味和口感.

因此，本文采用黑曲霉、米曲霉协同发酵杏仁粕，以氨基态氮含量和特征风味强度为考察指标，通过感官评价和仪器测定的方法，研究影响杏仁粕发酵过程中风味物质的关键因素，使杏仁粕在微生物发酵下有效风味成分充分释放，赋予杏仁粕丰满的风味，为杏仁粕制曲产肉味香精基料提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

杏仁粕，张家口永昌源果仁食品有限公司；黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)菌粉，山东康源生物技术有限公司.

甲醛、三氯乙酸(TCA)，分析纯，天津市津科精细化工研究所；石油醚，分析纯，天津市津东天正精细化学试剂厂；硼酸，分析纯，天津市大茂化学试剂厂.

DW-86L386型超低温冰箱，青岛海尔股份有限公司；TDZ5-WS型低速离心机，长沙湘仪离心机有限公司；自动凯氏定氮仪，山东海能科学仪器有限公司；HFU586BASIC型立式超低温冰箱，德国Thermo Scientific公司；Evolution300型紫外可见分光光度计，Thermo Fisher Scientific 公司；LE438型pH电极，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；Trace1300 ISQ型气质联用仪，苏州冷杉精密仪器有限公司.

1.2 制曲方法

材料预处理：杏仁粕经过粉碎机粉碎，80目过筛，密封备用.

制曲流程：取粉碎、过筛后的杏仁粕10g装入三角瓶，120℃高压蒸汽灭菌30min，降温取出迅速打散，待温度降至室温，根据杏仁粕的质量接种5%的混合菌粉(黑曲霉、米曲霉)，再加入适量水，混合均匀.30℃恒温培养5d，当瓶内布满菌丝且菌丝联结基质成块后翻曲，最后出曲.

1.3 测定方法

挥发物含量测定：参考GB/T 14489.1—2008《油料水分及挥发物含量测定》方法；氨基态氮的测定：采用甲醛滴定法，参考ZB X 66038—1987《氨基态氮测定法》.

曲料风味强度的评定：具体方法参照文献[7]高温大曲质量的评分，风味强度＝外观＋皮厚＋断面＋香气.在前人研究方法的基础上，选择外观、皮厚、断面、香气等感官评价标准，评分标准见表1.筛选14名经过培训的小组成员(男7名，女7名，年龄23～48岁)进行描述性感官评价分析.

表1 曲料质量评分指标Tab. 1 Standards for evaluation of koji quality

顶空固相微萃取(HS-SPME)：准确称取5g样品于20mL的样品瓶中，(60±0.5)℃水浴恒温平衡15min，将三相萃取头插入样品瓶中顶空萃取40min后取出萃取头，再插入GC-MS进样口解析15min，检测其挥发性组分.色谱条件：色谱柱为TR-5MS型石英毛细管柱(30m×0.32mm×0.25µm)；进样口温度250℃；初始温度40℃，保持3min，以4℃/min升到150℃保持4min；载气为高纯氮气，不分流模式，流量为1mL/min.质谱条件：连接口温度250℃，EI离子源，电子能量70eV，离子源温度300℃，质谱扫描范围(m/z)50～300.

1.4 杏仁粕曲料风味的影响因素优化

1.4.1 单因素实验

菌种比对曲料风味的影响：按照米曲霉与黑曲霉质量比(g﹕g)为1﹕0、0﹕1、2﹕1、3﹕1、4﹕1进行发酵，发酵温度37℃，水料比(mL﹕g)为1﹕1.以氨基态氮含量和风味强度为指标确定适宜菌种比.

水料比对曲料风味的影响：在上述确定的适宜菌种比的基础上，按照水料比(mL：g)为0.2﹕1、0.4﹕1、0.6﹕1、0.8﹕1、1.0﹕1进行发酵，发酵温度37℃.以氨基态氮含量和风味强度为指标确定适宜水料比.

发酵温度对曲料风味的影响：在上述确定的适宜菌种比和水料比的基础上，按照25、30、35、40、45℃的发酵温度进行发酵，以氨基态氮含量和风味强度为指标确定适宜发酵温度.

1.4.2 响应面分析

以菌种比、水料比、发酵温度3个因素的不同设定条件进行优化，测定曲料中的物质风味强度和氨基态氮含量.在单因素的实验结果基础上，根据Box-Benhnken的中心组合实验设计，确定最佳工艺参数.

1.5 数据处理

单因素实验数据使用Origin9软件分析，Box-Benhnken的中心组合实验采用Design-Expert 10.0.7统计软件进行分析.所有实验均经过3次平行实验.

2 结果与分析

2.1 单因素实验对曲料风味的影响

杏仁粕发酵过程菌种比、水料比、发酵温度对曲料风味的影响如图1所示，其中不同字母表示组间有显著差异.

图1 培曲菌种比、水料比、发酵温度对氨基态氮含量和风味强度的影响Fig. 1 Effects of culture strains ratios，waters-material ratios and temperature on amino acid nitrogen and sensory properties

菌种比决定菌种在发酵过程中的生长繁殖速度，并直接决定发酵产物种类和含量[7].由图1(a)可知：曲料中氨基态氮含量和风味强度在发酵过程中的变化趋势相似，成曲的氨基态氮含量和风味强度随着黑曲霉的增加而减少，表明成曲中酸性蛋白酶活力较少，中性蛋白酶活力较高.氨基态氮含量和风味强度随米曲霉的增加而增加.在米曲霉和黑曲霉质量比为3﹕1时，氨基态氮含量和风味强度都达到最大值，表明中性蛋白酶活力较强[8].当米曲霉和黑曲霉质量比为4﹕1时，氨基态氮含量和风味强度都出现下降，可能是菌株分泌的酶下降导致.因此，初步确定米曲霉和黑曲霉的适宜质量比为3﹕1.

曲料水分与氨基态氮含量有重要关系.水分过多时，不利于各种酶类的代谢反应，造成曲料过稀，对于酶活力有一定的影响.由图1(b)可知：不同的水料比对氨基态氮的含量有影响，随着水分的增加，曲料中的氨基态氮含量呈现先增加后减小的趋势.水料比(mL﹕g)为0.2﹕1～0.4﹕1时，由于水分含量适宜，适合蛋白酶活性，将蛋白质分解成游离氨基酸，使氨基态氮含量增加，风味强度也随之逐渐增加[9].水料比为0.4﹕1时，曲料中的氨基态氮含量最高为1.197%，水料比超过0.4﹕1时，由于水分活度大，对蛋白酶起到抑制作用，蛋白酶分解蛋白的能力降低，使得曲料中氨基态氮含量逐渐减少.当水料比超过0.6﹕1时，曲料中氨基态氮含量和风味强度均随着水分的增加而下降，原因是微生物的生长需要适宜的水分，过多或过少的水分均会影响其生长繁殖，对其发酵产物产生影响[10]，水分的稀释作用也会对滋味和香气造成不利影响[11].因此，初步确定水料比的适宜比例(mL﹕g)为0.4﹕1.

发酵温度通过改变微生物的蛋白质、核酸的结构和活性进而影响微生物的代谢产物的生成种类和生长情况[12].由图1(c)可知：在制曲过程中，氨基态氮含量随着温度呈现先上升后下降的趋势.当培养温度达到30℃时氨基态氮含量达到最高，并显著高于其他组(P＜0.05)；从30℃升高到45℃的过程中，氨基态氮含量直线下降，这可能是由于温度高于30℃抑制了菌种发酵过程中产生的酶活性[13].相反，风味强度随着温度的升高而逐渐升高，这可能是由于温度越高，杏仁粕发生美拉德反应的产物越多，香气越厚重，风味强度越高.当温度高于40℃时，氨基态氮含量下降，不利于风味物质的产生，因此初步确定适宜发酵温度为30℃.

2.2 响应面实验结果

以米曲霉与黑曲霉质量比(A)、温度(B)、水料比(C)为因素，曲料的氨基态氮含量(Y1)和风味强度(Y2)为响应值进行制曲优化实验.响应面Box-Behnken实验设计与结果见表2.氨基态氮含量响应面模型的方差分析结果见表3.

表2 Box-Behnken实验设计与结果Tab. 2 Box-Behnken design and results

表3 氨基态氮含量的响应面方差分析Tab. 3 Analysis of variance of response surface of amino acid nitrogen

从表3中可以看出，模型的F值为19.79，P＞F小于0.05，说明总体该模型显著.该模型失拟项的P＞F为0.86，大于0.05，失拟项不显著，说明该模型选择合适，可以用于氨基态氮含量变化的分析.

显著影响因素对氨基态氮含量的交互作用如图2所示.菌种比和温度、温度和水料比之间存在显著的交互作用(P＜0.05)，与方差分析的结果一致.利用Design-Expert 10.0.7 分析软件对数据进行拟合得到氨基态氮含量的二次回归方程为

图2 显著影响因素对氨基态氮含量的交互作用Fig. 2 Interaction of significant influencing factors on amino nitrogen content

风味强度响应面模型方差分析结果见表4.

表4 风味强度的响应面方差分析Tab. 4 Analysis of variance for response surface of sensory properties

从表4中可以看出：模型的F值为15.56、“P＞F”小于0.05，说明总体该模型显著.该模型失拟项的“P＞F”为0.85，大于0.05，失拟项不显著，说明该模型选择合适，可以用于风味强度变化的分析.

显著影响因素对风味强度的交互作用如图3所示.从图3中可以看出，菌种比与温度之间存在显著的交互作用(P＜0.05)，与方差分析的结果一致.

图3 显著影响因素对风味强度的交互作用Fig. 3 Interaction of significant factors on flavor intensity

用Design-Expert 10.0.7分析软件对数据进行拟合，得到风味强度的二次回归方程为

Y2＝81.6－0.25A－3.38B＋9.63C－5.50AB＋1.50AC－0.75BC－5.18A2－5.93B2－2.43C2加权综合评分(Y)算法参考文献[14].本实验中曲料的氨基态氮含量和风味强度对曲料的风味同样重要，所以加权系数均定为0.5.

Y＝0.5Y1＋0.5Y2

即

Y＝41.35-0.06A-1.76B＋5.01C-2.83AB＋0.78AC-0.45BC-2.69A2-3.01B2-1.34C2

2.3 最佳工艺条件

综合以上对氨基态氮含量和风味强度的响应面模型进行数学分析，以加权综合评分最大化为指标，得到发酵的最优条件为米曲霉与黑曲霉质量比(g﹕g)0.375﹕0.125、温度30℃、水料比(mL﹕g)为0.5﹕1.此条件下发酵5d成曲的加权综合评分为43.10，氨基态氮含量为0.95%，风味强度为75.20.考虑到实际操作情况，将各条件修正为米曲霉与黑曲霉质量比(g﹕g)3﹕1、温度30℃、水料比(mL﹕g)0.5﹕1.在此条件下进行3次平行实验，氨基态氮含量为1.25%，风味强度为80.00，加权综合评分为40.61，与预测值接近.这说明该模型很好地预测了曲料的氨基态氮含量和风味强度，优化工艺条件可靠.

2.4 挥发性风味物质分析

杏仁粕发酵前后鉴定香气物质见表5.

共检测了22种主要成分，其中酯类3种、醛类5种、醇类5种、酮类1种、酸类2种、酚类2种、含氮化合物3种、杂环化合物1种.曲料风味物质主要为苯甲醛、苯甲醇、3–辛酮、苯甲酸甲酯和苯甲酸乙酯，其中醛类和酮类是含羰基化合物，是肉香的特征物质.醇类化合物主要是脂质的氧化降解或者是羰基化合物还原生成，主要具有花香、甜香和水果香.酯类化合物可以通过醇和有机酸酯化反应生产，一般赋予食品花香和果香.杂环化合物具有焦香味，可以使食物呈现烤肉香味[15].发酵后的醇类和酯类酸类总量均高于发酵前的杏仁粕，这与文献[16]研究结果一致，特别是发酵后总的醇类含量是未发酵的总醇类含量的6倍，是曲料产香的主体成分，也是形成酯类物质的前体，这使得曲料的风味大大增加[17].适量的酸也可以提高曲料的整体协调性[18].曲料生产的过程中，由于温度升高，曲料中的蛋白质和微生物残体自溶，转化为氨基酸等物质产生曲香[19].风味物质的差异是造成原样和曲料感官特征不同的主要原因.

3 结 语

以杏仁粕为制曲基质，对曲料中氨基态氮含量和风味强度的影响因素进行分析.结果表明，菌种比、水料比和发酵温度对杏仁粕曲料的风味都有影响，其影响程度由大到小依次为温度、水料比、米曲霉与黑曲霉质量比.当米曲霉与黑曲霉质量比(g﹕g)3﹕1、温度30℃、水料比(mL﹕g)0.5﹕1，发酵5d成曲的氨基态氮含量为1.25%、风味强度为80.00，杏仁粕曲料风味较好.对曲料进行挥发性风味成分进行分析，曲料风味物质主要为苯甲醛、苯甲醇、3–辛酮、苯甲酸甲酯和苯甲酸乙酯.与未发酵相比，发酵的杏仁粕颜色加深、风味加强，这为进一步研究发酵杏仁粕曲料风味，提高其应用价值奠定了基础.