海带多酚的提取分离纯化工艺研究

张怡评，杨婷，张红红，胡贤陈，晋文慧，方华，洪专，邱远望，黄鸣清

(1.自然资源部第三海洋研究所，海洋生物资源开发利用工程技术创新中心，福建 厦门 361005；2.福建中益制药有限公司，福建 泉州 362712；3.福建中医药大学药学院，福建 福州 350108)

海带(Laminariajaponica)，隶属于褐藻门(Phaeophyta)，褐藻纲(Phaeophyceae)，海带目(Laminariales)，海带科(Laminariaceae)，海带属(Laminaria)，为多年生海藻植物，中药名称为“昆布”，具有消痰软坚散结、利水消肿等功效，始载于汉末的《名医别录》。《嘉佑本草》记载海带能“去瘦行水，下气化痰”[1]。现代研究表明海带中含有多酚、多糖、活性碘、脂肪酸等多种有效成分，药理学研究表明海带提取物具有调节血脂、降血糖、降血压、抗凝血、增强免疫功能等[2]。其中，海带多酚作为褐藻海带中一类重要的多酚化合物，主要是以间苯三酚为结构单元的聚合物形式存在，其独特的结构赋予了海带多酚多种生物活性，包括抗氧化、抗肿瘤、抗菌等[3-8]。近年来，有一些关于海带多酚的提取工艺及活性评价的研究，但大都停留在多酚粗提取物上。如劳敏军等以超声波、微波为提取手段，确立微波辅助提取海带多酚的最佳提取工艺条件[9]；林晓等[10]采用响应面法优化海带中总多酚提取工艺，并采用粗提取物进行初步的抗氧化活性研究。本研究将采用一定浓度的乙醇溶液提取海带粗多酚，并采用大孔吸附树脂进行分离纯化，获得高纯度海带多酚。该方法操作简便，所制备的海带多酚含量较高，可为海带多酚类成分的开发应用奠定基础。

1 材料与试剂

1.1 仪器 HS-7磁力搅拌器(德国艾卡公司)；UH5300紫外可见分光光度计(日立株式会社)；DFT-200A万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；HH-ZK2水浴锅(巩义市予华仪器有限责任公司)；NT-901涡旋振荡器(海门市其林贝仪器制造有限公司)；H1650-W离心机(湖南湘仪实验仪器开发有限公司)。

1.2 材料 海带(采自福建省东山县，由福建远扬藻业股份有限公司提供)；

1.3 试剂 没食子酸(纯度：98%，批号：110831-201906，中国食品药品检定研究院)；福林酚试剂、碳酸钠、无水乙醇等(均为分析纯，购自汕头西陇化学试剂有限公司)；大孔吸附树脂(SZ-1、SZ-2、SZ-3、SZ-4、SZ-5、SZ-6，厦门科谱生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 海带多酚含量的测定 参照国标及文献方法，采用福林酚测定法进行测定[11-12]。精确称取没食子酸标准品，用水溶解并配制成20 μg·mL-1标准工作液。取6支10 mL具塞试管，分别精密加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的没食子酸标准溶液(20 μg·mL-1)，依次向试管中加入1.5 mL酚试剂和4 mL 8% 碳酸钠溶液，加水定容至10 mL，混匀后置于30 ℃水浴反应20 min，在765 nm波长处检测样品的吸光度A。以没食子酸标准液浓度(μg·mL-1)为横坐标，以其吸光度A为纵坐标作标准曲线，回归方程为Y=0.014 2X+0.013 2，R2=0.998，在4～20 μg·mL-1浓度范围有良好的线性关系。吸取样品液1 mL自加入福林酚试剂起按照步骤进行测定吸光度，用标准曲线计算多酚含量。

2.2 海带多酚提取单因素试验 取洗净干海带，粉碎，过80目筛，分别以乙醇水溶液(50%、60%、70%、80%和90%)、提取时间(0.5、1、1.5、2、2.5和3 h)、提取温度(40、50、60、70、80和90 ℃)、料液比(1∶25、1∶35、1∶45、1∶55、1∶65和1∶75)为单因素进行考察，筛选正交试验因素及水平。

2.3 海带多酚提取工艺优化 在单因素基础上采用4因素3水平正交试验设计进行优化。乙醇浓度(65%、75%和85%)，提取时间(0.5、1.0和1.5 h)，提取温度(55、65和75 ℃)，料液比(1∶45、1∶55和1∶65)，正交试验设计因素水平表见表1。

表1 正交试验设计因素水平表

2.4 海带多酚柱层析分离纯化

2.4.1 树脂的选择 称取经过预处理的上述6种吸附树脂(SZ-1、SZ-2、SZ-3、SZ-4、SZ-5、SZ-6)各1.0 g置于50 mL三角瓶中，分别加入30 mL海带多酚提取液，于30 ℃下振摇吸附24 h后过滤，测定滤液中的海带多酚含量，原液中多酚含量扣除吸附后溶液中剩余的多酚量即为被树脂吸附的多酚量。

2.4.2 洗脱剂乙醇浓度的选择 称取5.0 g经过预处理的SZ-3树脂置于300 mL三角瓶中，加入150 mL一定浓度(4.3 mg·mL-1)的海带多酚提取液，30 ℃下振摇吸附5.0 h后过滤，测定滤液中海带多酚的总量。再将树脂平均分成5份，分别用50 mL不同浓度乙醇溶液(20%、40%、60%、80%、100%)在30 ℃下振摇解析4 h后过滤，测定滤液中海带多酚的总量。溶液中多酚含量越高，说明该溶液越能解析海带多酚。

2.4.3 柱层析纯化 称取80 g经过预处理的SZ-3树脂，湿法装柱(3×20 cm)，以1.5 mL·min-1的流速上样(体积175 mL、浓度5 mg·mL-1)海带多酚提取液，上样完成后，先以3倍柱体积水洗脱，弃去洗脱液，后采用80%乙醇溶液以1.5 mL·min-1的流速洗脱，分管收集洗脱液，测定不同浓度的乙醇溶液对SZ-3树脂吸附的多酚物质的动态解析效果，分段收集，并取多酚含量较高的洗脱组分，浓缩，冻干，测定样品中多酚含量。

3 结果

3.1 单因素试验结果

3.1.1 不同浓度乙醇溶液对海带多酚提取率的影响 采用加热搅拌提取的方法，固定提取时间1.0 h，提取温度60 ℃，料液比(乙醇∶海带，mL·g-1)1∶35，观察不同乙醇浓度对海带多酚提取率的影响，结果见图1。

图1 乙醇浓度对多酚提取率的影响

提取浓度对多酚的提取率结果表明：多酚的提取率随着乙醇浓度的升高而呈这件上升的趋势，但当乙醇溶液的浓度超过80%后，多酚提取率便开始下降，可能是由于太高浓度的乙醇溶液可能导致溶出较多的醇溶性杂质、色素以及亲脂性强的成分，使提取率降低。因此，正交试验乙醇体积分数应在65%～85%。

3.1.2 提取时间对多酚提取率的影响 固定提取温度60 ℃，乙醇体积分数75%，料液比(乙醇∶海带，mL·g-1)1∶35，观察不同提取时间对海带多酚提取率的影响，结果见图2。

图2 提取时间对多酚提取率的影响

提取时间多多酚提取率的影响结果表明：提取时间为1.0 h时，提取率最高，而提取时间超过1 h后提取率呈下降趋势，可能是因为多酚化合物物稳定性较差，在1 h时大部分多酚已经被提取出，延长提取时间将延长多酚加热时间以及光照时间，使得多酚类成分被氧化或降解。因此，选择0.5～1.5 h为正交试验中提取时间范围。

3.1.3 提取温度对多酚提取率的影响 固定提取时间1.0 h，乙醇体积分数75%，料液比(乙醇∶海带，mL·g-1)1∶35，观察不同提取温度对海带多酚提取率的影响，结果见图3。

图3 提取温度对多酚提取率的影响

提取温度对多酚提取率的影响结果表明：随着提取温度的升高多酚化合物的提取率呈先上升后下降的趋势，这是由于温度升高，多酚的溶解、扩散速度加快，因而更易于从原料中溶出。但是当温度超过60 ℃时，提取率迅速降低，可能是由于多酚属于热敏性物质，高温导致部分的海带多酚类物质氧化破坏。因此，选择55～75 ℃为正交试验的提取温度范围。

3.1.4 料液比对多酚提取率的影响 固定提取时间1 h，提取温度60 ℃，乙醇溶液浓度为80%，观察不同料液比(乙醇∶海带，mL·g-1)对海带多酚提取率的影响，结果见图4。

料液比(乙醇∶海带，mL·g-1)是影响多酚提取率的最重要因素之一，适当的料液不仅可以减少溶剂的浪费，而且能够比较高效的获得目标物。由图4可以看出，随着料液比的增大，多酚的提取率逐渐上升，当料液比达到55 mL·g-1时，海带多酚的提取率达5.27 mg·g-1，继续增大料液比，使得溶剂对超声的吸收增大，细胞对超声的吸收减少，多酚从细胞中的溶出量减少，提取率降低[9]，但当料液比超过1∶65时，提取率基本不再增加。因此，初步确定正交试验的料液比(乙醇∶海带，mL·g-1)在1∶45至1∶65之间。

图4 料液比对多酚提取率的影响

3.2 正交试验结果 在海带多酚提取单因素试验结果基础上，以海带多酚提取率为评价指标，以乙醇浓度(A)、提取时间(B)、提取温度(C)和料液比(D)为4个提取因素，每个因素设定3个水平，采用4因素3水平正交试验法进行提取工艺优化，按照“2.1”的方法进行测定，试验结果见表2。

表2 正交试验结果

表3 方差分析结果

由表2可得，乙醇浓度对多酚的影响最大，提取温度次之，料液比影响最小，方差分析结果表明，乙醇浓度和提取温度对多酚提取具有显著性影响。从直观分析结果可得，最佳的提取工艺为A2B2C3D3，即采用料液比1∶65，乙醇浓度为75%，在75 ℃下提取1.0 h。

3.3 海带多酚柱层析分离纯化

3.3.1 树脂的选择 称取经过预处理的上述6种吸附树脂(SZ-1、SZ-2、SZ-3、SZ-4、SZ-5、SZ-6)各1 g，分别加30 mL海带多酚提取液(4.3 mg·mL-1)，于30 ℃下振摇吸附24 h后过滤，测定滤液中的多酚含量并求算树脂吸附量。

由表4结果可得SZ-3树脂对海带多酚的吸附量最大，达到53.5 mg·g-1，后续将以此为吸附树脂考察解析条件与层析条件。

表4 不同树脂吸附量考察

3.3.2 解析剂乙醇浓度的选择 选取5 g SZ-3树脂按照“2.4.2”项下方式处理后，将树脂平均分成5份，分别用50 mL不同浓度乙醇溶液，在30 ℃下振摇解析4.0 h后过滤，测定洗脱液中海带多酚的总量，溶液中多酚含量越高，说明该溶液越能解析海带多酚。

如图5所示，20%乙醇即有部分多酚被解析，因此，不宜采用20%乙醇进行洗脱杂质。乙醇浓度从20%到80%，海带多酚的解析率逐渐上升，最大时候解析率为94.29%；当乙醇浓度超过80%时，解析率逐渐下降。因此，选用80%乙醇溶液作为海带多酚的解析剂。

图5 乙醇浓度对多酚静态解析的影响

3.3.3 柱层析纯化 按照“2.4.3”项下方法进行装柱，上样与洗脱，分管收集洗脱液，测定室温下乙醇溶液的动态洗脱效果，收集富含多酚的洗脱组分，浓缩，冻干，测定样品中多酚含量。

如图6可以看出，动态解析条件下SZ-3树脂上吸附的多酚物质易被洗脱，多酚物质的洗脱高峰也相对比较集中，当采用80%乙醇溶液洗脱，洗脱液体积为80～130 mL时的海带多酚含量较高，最高浓度可达21.03 mg·mL-1。收集多酚含量较高的多酚洗脱液，浓缩后进行冷冻干燥，按照“2.1”项下方法测定该组分海带多酚的含量为80%，多酚的回收率达到75%。

图6 海带多酚的动态洗脱曲线

4 讨论

海带多酚是一类主要存在于海带中的多酚类化合物，主要是以间苯三酚为单元进行生物合成得到的低聚物，可发展成为天然抗氧化剂或食品添加剂，从而提高海带的综合利用价值[13]。与其他多酚类化合物相似，海带多酚也具有多种药理活性，包括抗氧化、抗癌、抗炎、抗菌及血管紧张素转化酶抑制作用等[13-17]。本研究通过单因素试验和正交试验确定了提取海带多酚类物质的最佳提取工艺条件，即料液比(乙醇∶海带，mL·g-1)1∶65，乙醇浓度为65%，提取温度75 ℃，提取时间1 h。通过试验发现，在该条件下总多酚的一次提取率即可达到83%，因此，本研究选择提取1次。通过对6种层析填料的筛选及层析条件的优化，最终确定以SZ-3大孔吸附树脂为最佳的分离填料，在所建立的层析条件分离获得海带多酚纯度最高可达80%。本研究可为进一步深入开展对海带多酚提取及开发应用提供基础参考。