包覆涂层的可溶性微针的制备及性能测试

陈健敏，刘欣莹，刘思弯，何泽敏，余思锦

(1.莆田学院 药学与医学技术学院，福建 莆田 351100；2.药物分析与检验医学福建省高校重点实验室, 福建 莆田 351100)

经皮给药系统(transdermal drug delivery system,简称TDDS)因其携带及使用较为方便，能避免肝脏首过效应、维持稳定的血药浓度而减少副作用、提高患者依从性等优点，具有巨大的市场前景.微针(microneedles, 简称MNs)作为一种新型的TDDS技术，具有高效、无痛和安全的特点，能有效打破角质层对药物的屏障作用，提高药物递送效率，广泛用于小分子亲水性药物和生物大分子的递送.近年来，采用水溶性高分子材料为基质制备的可溶性微针(dissolving microneedles,简称DMNs)，受到了科学界的广泛关注.DMNs作用于皮肤后，可溶性针体吸收皮肤中的组织液，便发生溶解，包埋的药物随即释放，在局部产生作用或经皮肤内的毛细血管进入体循环而产生全身效应.然而，由于水溶性材料的溶解速度较快，药物吸收过程的时间与注射给药吸收过程相近，这样不利于缓释药物的递送.因此，笔者通过在可溶性微针针体上包覆一层涂层，以达到药物缓释的目的，此项研究在国内外未见报道.该研究先采用溶液浇铸法制备针体载药的可溶性微针(tip-loaded dissolving microneedles, 简称TDMNs)，然后通过笔者课题组自行组装的旋涂机，将缓释涂层均匀地涂布在微针针体上，形成包覆涂层的针体载药的可溶性微针(coated TDMNs，简称CTDMNs)，详细考察高分子涂层材料和浓度、旋涂的转速等各种参数对药物释放的影响规律，同时对其力学性能和安全性进行评估.

1 材 料

1.1 仪 器

700D单反相机，佳能；BSM电子天平，上海卓精科技有限公司；YB-P6智能透皮仪，北京新诺华仪器有限公司；JJ-1AS数显增力电动搅拌器，常州朗越仪器制造有限公司；Handpi-NK-50测力仪，深圳市艾尔玛机电；HLA数显螺旋测试机架，艾得堡仪器；Finland经皮水分流失仪，Delfin Technology；UV2550紫外可见光分光光度计，日本岛津；Spectrofluorometer FS5荧光分光光度计，英国爱丁堡.

1.2 药品与试剂

聚苯乙烯(PS，批号：D8945)、聚乳酸(PLA，批号：P169115)、明胶(GL，批号：C1603064)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP K29-32，批号：J1431062)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙酸乙酯(批号：J1530023，纯度：AR)、核黄素(批号：C1603016,纯度：98%)、荧光素钠(批号：F1426015，纯度：AR)、罗丹明B(批号：W5696，纯度：AR)，山东西亚化学股份有限公司；美洛昔康(批号：N0906A，纯度：AR)，大连美仑生物技术有限公司.

1.3 皮肤模型与实验动物

雄性SD大鼠((200±10)g)购于福建省闽侯县吴氏实验动物贸易有限公司.大鼠饲养在(22±1)℃，相对湿度为40%～60%，12 h明暗循环的动物房中，自由采食，至少适应1周.动物相关的试验步骤与方法均严格按照莆田学院动物伦理委员会的批件执行.大鼠用5%水合氯醛溶液(剂量为0.7 mL/100 g)麻醉后处死，进行脱毛处理，取腹部皮肤，用PBS溶液洗净，分装于自封袋中，放入冰箱冷冻室(—20 ℃)储藏备用.实验前，取出鼠皮，在PBS溶液中浸泡1 h后再使用.进行经皮水分流失试验时，提前一天将SD大鼠腹部进行脱毛处理，在整个试验过程中大鼠作麻醉处理.

2 实验方法

2.1 包覆涂层的针体载药的可溶性微针(CTDMNs)的制备

针体载药的可溶性微针的制备方法采用笔者课题组之前报道的方法，并做微小的调整.首先，将含有药物的PVP针体溶液(10%)，注入PDMS微针模具中，使溶液均匀覆盖模具表面，然后加压使溶液进入模具微孔，待其干燥后在模具中加入熔融的PCL，待其凝固后脱模，获得TDMNs.用镊子夹住TDMNs的背衬边缘，将其用胶水固定在自制的旋涂机上，浸入高分子溶液(例如乙酸乙酯为溶剂的1% PLA、GL和PS高分子溶液)后立即提起，启动旋涂机，带动TDMNs快速旋转，将多余的高分子溶液甩出，在TDMNs针体表面形成一层薄的高分子涂层，室温干燥后即得到CTDMNs.该制备过程如图1所示.

图1 包覆涂层的针体载药的可溶性微针(CTDMNs)的制作流程

2.2 各参数对CTDMNs中药物释放行为的影响

能够有效影响药物释放行为的参数主要包括：高分子涂层材料的种类和浓度，旋涂机的转速，包覆涂层的次数等.在以下试验中，若无特殊说明，均以罗丹明B为模型药物制备TDMNs，再进行涂层包覆试验.试验采用单因素变量的方法，考察不同参数对药物释放行为的影响.首先考察不同高分子涂层材料对药物释放的影响，将PLA，GL，PS分别溶于乙酸乙酯中配制成1%的高分子涂层溶液，设置转速为600 r·min，包覆涂层次数为1次.根据结果发现PS涂层的缓释能力较强，因此固定转速为600 r·min，包覆涂层次数为1次，配制不同浓度(1%，3%，5%，10%)的PS溶液，考察高分子涂层溶液浓度对药物释放行为的影响.确定最佳浓度的PS后，再固定包覆涂层次数为1次，考察转速对药物释放行为的影响.最后固定最佳浓度的PS，转速为600 r·min，考察包覆涂层次数对药物释放行为的影响.

采用智能透皮仪探究药物的释放速率，具体步骤如下：用胶水将CTDMNs的背衬固定在一个圆形塑料片上，然后针尖朝下扣在Franz透皮杯的接收池上，再将给药池扣在塑料片上，夹上马蹄铁，然后往接收池中加入PBS溶液.将Franz透皮杯置于水浴中(37 ℃)，磁子以 280 r·min的速度搅拌，开始试验.在试验的0.5，1，2，4，6，8，10，20，40，60 min，从接收池中取出全部接收液，并立即加入等量的PBS.每组3个平行(

n

=3)，采用紫外分光光度法检测接收液中的罗丹明B(测定波长为556 nm)的含量，所获得的标准曲线方程为

Y

=0.119 3

X

-0.001 0(

R

= 0.999 6)，浓度范围为0.01～10 μg·mL.计算每个时间点的药物累积释放量，再将其对时间作图.

2.3 不同药物对释放行为的影响

药物的释放行为与药物本身的性质有关，笔者所提到的包覆涂层的方法是否适用于其他药物的缓释，尚不可知.因此，除了之前探索旋涂条件时采用的药物罗丹明B之外，又随机挑选了3种药物进行研究，包括核黄素、美洛昔康和荧光素钠.首先配制3种药物的溶液(1%)，然后按照2.1的方法制备CTDMNs，各参数设置如下：1%PS、转速600 r·min、包覆涂层次数为1次.仍采用智能透皮仪考察药物的释放速率，如2.2所述.采用紫外分光光度法测定接收液中的美洛昔康(测定波长为362 nm)的含量，标准曲线方程为

Y

= 0.054 3

X

+0.001 9(

R

=0.997 8)，浓度范围为0.01～10 μg·mL.采用荧光分光光度法测定接收液中核黄素(激发波长为440 nm、发射波长525 nm)的含量，标准曲线方程为

Y

= 66.743

X

+5.583 3(

R

=0.994 6)，浓度范围为0.01～4 μg·mL.采用荧光分光光度法测定接收液中荧光素钠(激发波长为491 nm、发射波长512 nm)的含量，标准曲线方程为

Y

= 145.8

X

-3.872 8(

R

=0.999 9)，浓度范围为0.01～8 μg·mL.计算每个时间点的药物累积释放量，再将其对时间作图.

2.4 力学性能考察及皮肤穿刺试验

用Handpi-NK-50测力仪和数显螺旋测试机架搭建的微针力学强度测试仪，测试CTDMNs的力学性能.简单来说，先把微针置于底座上，针尖朝上，再将测试仪的平头铝制圆柱探头(直径10 mm)以0.5 mm·min的恒定速度垂直向下移动至CTDMNs的尖端，并记录位移和力值，直至达到预设的最大位移(0.5 mm).在试验过程中，当力达到0，10，20，30，40，50 N时，暂时取下CTDMNs进行观察并拍照.为了考察CTDMNs对皮肤的穿刺能力和效率(penetration efficiency，简称PE)，用大拇指将包埋罗丹明B的CTDMNs压入离体大鼠皮肤；按压10 min后，取下的CTDMNs和被处理后的皮肤用显微镜和单反相机(配微距镜头)观察并拍照.PE(%)的计算公式如下：PE(%)=(染色孔数/微针数)×100.

2.5 经皮水分流失测试与皮肤恢复情况

动物试验开始前采用水合氯醛进行麻醉处理，再将SD雄性大鼠腹部进行脱毛处理，然后用大拇指将CTDMNs作用于腹部皮肤，10 min后移除.采用经皮水分流失测试仪记录每个固定时间点(10 min，30 min，1 h，2 h，3 h，4 h，5 h，6 h)的经皮水分流失(transepidermal water loss，简称TEWL)情况.靠近微针作用位点的临近部位皮肤作为空白对照.实验重复3次(

n

=3)，TEWL值以g·m·h表示.在处理前、处理后(0 min,10 min，30 min，1 h，2 h，3 h，4 h，5 h)，用单反相机记录大鼠腹部皮肤的恢复情况.

2.6 数据处理与统计分析

每个试验至少做3次平行(

n

=3)，数值用平均值±标准偏差(SD)表示.采用微软Excel软件(2007版)对数据进行分析处理.采用单因素方差分析(ANOVA)和学生

t

检验进行统计学分析.

p

值小于0.05被认为具有统计学意义.

3 结果与讨论

3.1 CTDMNs的基本形态特征

以罗丹明B作为模型药物，将其包埋在可溶性微针的针体内，制备的TDMNs(图2(a))完整地复制出了微针的结构，12 × 12 的微针阵列，每根微针长度为680 μm, 基底的边长为380 μm，针尖距离为600 μm，整个微针阵列的面积约0.75 cm，而且药物基本都集中于针体部位.在包覆一层PS涂层后，微针的整体形貌未发生较大的变化，似乎蒙上一层透明薄膜，如图2(b)所示.为了更好地观察包覆的PS涂层，制备了不含药物的空白微针，如图2(c)所示.然后在PS溶液中加入苏丹红，仍采用上述方法涂布，结果发现一层含苏丹红的PS涂层均匀地涂布在微针表面(图2(d))，表明上述方法确实成功地在微针表面形成一层涂层.

(a)TDMNs；(b)包覆PS涂层的TDMNs；(c)不含药物的空白微针；(d)包覆含苏丹红的PS涂层的TDMNs.

3.2 各参数对药物释放行为的影响

如何选择合适的高分子涂层材料十分重要，这直接关系到CTDMNs的缓释效果.而涂层材料需要溶解形成溶液才能方便涂布，而使用的溶剂又不能快速溶解TDMNs的针体材料(PVP).因此，高分子涂层材料溶剂的选择受到较大的限制，通过预实验研究，最终确认乙酸乙酯作为高分子涂层材料的溶剂.以乙酸乙酯作为溶剂，通过溶解度的预试验初步选择了PLA，GL，PS作为进一步优选的高分子涂层材料，并对材料种类对药物释放行为的影响进行了研究，结果如图3(a)所示.PLA涂层中药物释放速率与未包覆涂层的对照组(Control)相比，并没有显著性差异(

p

>0.05)，说明PLA涂层缓释能力较差.GL和PS组各个时间点的释放率均显著低于对照组(

p

<0.05)，表明这两种材料在TDMNs上形成的涂层均能实现药物的缓释.更具体地来看，对照组在5 min左右的释放率已基本达到100%，而PS组在60 min时才释放95.8%.因此后续试验均采用安全无毒的PS作为高分子涂层材料，而且其良好的物理机械性能也有助于增强微针的机械强度.为了探索PS浓度对药物释放的影响，采用上述方法将1%，3%，5%，10%的PS溶液分别涂布在TDMNs上，结果如图3(b)所示.随着PS浓度的增加，药物的缓释效果也逐渐增强，每组在每个时间点的释放率均显著低于对照组(

p

<0.05).然而增强幅度却随着PS浓度的增加有所下降，3%组和5%组之间的释放率并没有显著性差异(

p

>0.05).虽然10%组的释放率显著低于3%组的，但是当PS浓度达到10%时，溶液已经相对黏稠，不利于溶液的均匀涂布.因此综合考虑，后续的试验均采用浓度为3%的PS溶液.

不同转速(400，600，800 r·min)对药物释放行为的影响如图3(c)所示，随着转速的提高，药物的释放率显著下降，因此可以通过控制转速来控制CTDMNs的药物释放速度.值得注意的是，在试验过程中，发现转速低于400 r·min，不容易将微针上的高分子溶液甩出，导致涂布不均匀，因此涂布过程转速应高于该转速.在600 r·min的转速下，又考察了包覆涂层次数对药物释放的影响，结果如图3(d)所示.结果发现，随着包覆涂层次数的增加，药物释放速率也有规律地缓慢下降，虽然下降程度较小，但是仍然可以通过包覆涂层次数控制药物的释放速度.因此，可以通过调节高分子涂层材料的种类与浓度、旋涂机的转速和包覆涂层次数来实现药物的缓控释.

图3 各参数对药物释放行为的影响

3.3 不同药物在CTDMNs内的释放

4种药物(荧光素钠(Sodium fluorescein)、罗丹明B(Rhodamine B)、核黄素(Riboflavin)和美洛昔康(Meloxicam))均分别被包埋在TDMNs中，采用上述包覆涂层的方法，成功制备了4种不同的CTDMNs，如图4(a)所示.4种药物均被包埋于TDMNs针体内，而且包覆涂层后的CTDMNs均保持微针形态的完整.包埋荧光素钠的CTDMNs的缓释效果如图4(b)所示，空白对照(Control)在10 min时的释放率已经达到98.5%，而包覆1%PS涂层后，直到60 min才释放98.5%，表明涂层起到了缓释作用.包埋罗丹明B(图4(c))的CTDMNs的缓释效果已在前面提及，在此不再赘述.同样地，与相应的空白对照相比，包埋核黄素(图4(d))和美洛昔康(图4(e))的CTDMNs释放速率均显著下降(

p

<0.05).从PubChem中查询4种药物的溶解度数据如下：100 mL水中可溶解荧光素钠10 g(20 ℃)、罗丹明B 5 g(20 ℃)、核黄素8.47 mg(25 ℃)、美洛昔康0.715 mg(25 ℃)，由此可见，荧光素钠属于易溶于水的药物，罗丹明B属于可溶于水的药物，核黄素和美洛昔康均属于难溶于水的药物.把4种药物的释放速率汇总比较(图4(f))，可以看出药物的溶解度越低，释放速度越慢，也表明该包覆涂层的方法可使易溶性和难溶性药物均实现缓释作用.

(a)包埋4种不同药物的CTDMNs；(b)～(e)分别为包覆1%PS涂层前、后的可溶性微针荧光素钠、罗丹明B、核黄素、美洛昔康的释放速率；(f)包埋4种不同药物的CTDMNs的释放比较.

3.4 力学性能考察及皮肤穿刺试验

通过自制的微针力学强度测试仪，测试CTDMNs的力学强度，结果如图5(a)所示.从图中可以看出，在微针阵列受到小于30 N压力的作用时，微针针尖形貌基本没有变化.当压力大于30 N，微针针尖才稍微变钝，直到压力为50 N时，针尖形貌变化才更加明显.虽然针尖变钝了，但是没有发现有针尖发生明显断裂的情况，表明CTDMNs具有较强的韧性.一片CTDMNs上共有144根微针，压力为30 N时，每根微针的压力为0.21 N.根据文献[17]报道，微针针尖压力达到0.03 N·tip就能够刺入皮肤，笔者试验的微针能够承受的压力是其7倍，因此可以预见CTDMNs具有足够的力学强度刺入皮肤.这也被接下来的穿刺试验所证实，结果如图5(b)所示，CTDMNs作用于皮肤10 min后，针体前端部分已基本溶解.作用后的皮肤上形成了染色的微孔，清晰明显的染色孔数达到了约140个，穿刺效率达97.2%.虽然CTDMNs具有足够的机械强度，但穿刺效率未达到100%，原因可能是由于皮肤具有的弹性和毛发产生的阻力所致.试验结果表明CTDMNs具有足够的机械强度刺入皮肤，而且药物能够有效地释放进入皮肤.

图5 力学性能考察及皮肤穿刺试验

3.5 经皮水分流失与皮肤恢复情况

TEWL是最重要的皮肤屏障特征之一，其异常与皮肤屏障损害有关.因此，通过测量TEWL值，可以评估CTDMNs对皮肤的损伤和随后的皮肤恢复情况，结果如图6(a)所示.CTDMNs作用皮肤后，TEWL值即刻增加至(54.03±3.85)g·m·h，远高于空白对照组((13.50±1.65)g·m·h)，表明CTDMNs能有效地刺穿皮肤，从而打破皮肤的屏障效应.实际上，CTDMNs作用后会立即在皮肤上产生数百个微孔，如图6(b)所示.随着时间的增加，TEWL值在最初的2 h内急剧下降，这表明皮肤正在迅速恢复其屏障功能.更具体地看，6 h后CTDMNs的TEWL值下降到(13.80±1.37)g·m·h，与对照组((12.2±1.69)g·m·h)无显著性差异(

p

>0.05)，表明皮肤已完全恢复其屏障作用.皮肤屏障功能的迅速恢复降低了潜在的感染风险，说明CTDMNs具有较高的安全性，可以频繁使用.

图6 CTDMNs作用皮肤

4 结束语

笔者建立了一种在可溶性微针上包覆一层缓释涂层的方法，成功制备了CTDMNs，并对影响药物释放的各个参数，包括高分子涂层材料的种类和浓度、旋涂机的转速、包覆涂层的次数等，进行了研究并实现了药物的缓控释.采用这种方法对包埋核黄素、罗丹明B、美洛昔康和荧光素钠4种药物的微针进行涂层的包覆，均实现了缓释效果，证明了该方法的普适性.根据力学强度测试和皮肤穿刺试验的结果，表明所制备的CTDMNs具备足够的力学强度，足以刺入皮肤而不断裂.经皮水分流失试验和皮肤恢复情况表明CTDMNs作用后6 h，皮肤基本恢复屏障作用，表明由微针引起的微孔已基本愈合，证明该微针的使用相对安全.综上所述，笔者所制备的CTDMNs具有一定的缓控释能力，具备成为药物载体的潜力.