基于高通量测序的中国水仙根际土壤微生物群落组成

李媛媛 张琼 陈小煌 张敬虎 陆銮眉

摘要：【目的】明確中同水仙植株根际土壤微生物群落的组成特征。【方法】采用Illumina Miseq高通量测序技术对水仙根际土壤微生物样品的保守基因区进行测序及生物信息学分析，阐明中同水仙根际土壤的细菌、真菌和^菌群落结构组成，并对水仙根际土壤微生物的优势菌属进行深入分析。【结果】共获得优化序列175840条，基于97%序列相似度，聚类为2 680个OTUs。优势细菌类群是绿弯菌门Chloroflexi（ 30.86%）和变形菌门Proteobacteria（20.67%），真菌以子囊菌门Ascomycota（84.94%）为主，属水平上球毛壳菌Chaetomium globosum（ 28.15%）和散子囊菌Eurotiales（ 25.01%）占较高比例。占菌类群主要为奇^菌门Thaumarchaeota（ 51.40%）、深^菌门Bathyarchaeota（25.98%）和广古菌门Euryarchaeota（ 20.65%）。其中，来自奇古菌门的SCG类群（25.67%）和嗜酸性氨氧化古菌Candidatus Nitrosotalea（ 12.93%）占较高比例。【结论】中国水仙根际土壤微域具有丰富多样的微生物类群，这对于开发和利用水仙根际土壤微生物资源具有重要意义。

关键词：中国水仙;根际土壤微生物;高通量测序;细菌;真菌;^菌

中图分类号：S682

文献标志码：A

文章编号：1008-03 84（2021）08-0948-08

High-throughput Sequencing on Microbial Community in

Rhizosphere Soil of Chinese Narcissus

LI Yuanyuan 1， ZHANG Qiong 1， CHEN Xiaohuang 2， ZHANG Jinghu 1， LU Luanmei 1*

（I.Provincial Key Laboratory of Landscape Plants with Fujian and Taiwan Characteristics/College of the Bioscience and

Technology， Minnan Normal University， Zhangzhou， Fujian 363000. China; 2. College of the Chemistry， Chemical

Engineering and Environment. Minnan Nonral Universily. Zhangzhou， Fujian 363000. China ）

Abstract： 【Objective】The microbial community in thizosphere soils ofChinese narcissuses was analyzed.【Method】TheIllumina Miseq high-throughput sequencing technology was used to obtain the relevant conserved gene regions of the microbesin soil specimens from Chinese narcissus planting lots. The community structures and distributions of dominant species ofbacteria， fungi， and archaea in the thizosphere soils were analyzed. 【Resultl】In total. 175 840 optimized sequences wereobtained and clustered from the specimens int0 2 680 representative OTUs with a 97% similarity. The dominant bacteria wereChloroflexi （30.86%） and Proteobacteria （20.67%）. Among the fungi， Ascomycota （84.94%） significantly overshadowed theothers. with Chaetomiumm、 globosum （28.15%） and Asconycetes （25.01%） accounted for the greater proportions. On archaea，Thaumarchaeota （51 .40%）， Bathyarchaeota （25.98%）. and Euryarchaeota （20.65%） were the maj or phyla that had 25.67% SCGand 12.93% acidophilic ammonia oxidizing members. 【Conclusion】The thizosphere soils of Chinese narcissuses harboreddiverse and rich microbial species. The information obtained would aid the development and utilization of the natural resources.

Key words： Chinese narcissuses; thizosphere soil microorganisms; high-throughput sequencing; bacteria; fungi; archaea

0 引言

【研究意义】中国水仙（Narcissus tazetta L.var.chinensis Roem.）是石蒜科多年生草本植物，原产我国，已有一千多年栽培历史，独具天然丽质，芬芳清新，素洁幽雅，是我国十大观赏名花之一，观赏价值极高，在园林造景中也有广泛应用。近年来，很多研究揭示了植物根际一土壤一微生物之间的相互作用机制，探明中国水仙根际土壤微生物群落分布特征对于解析中国水仙的生态生存机制具有重要意义[1-3]。但目前对中国水仙根际土壤微生物群落组成的认知仍然有限，尤其对水仙根际土壤真菌和古菌的群落水平鲜有报道，从而不能深入解析水仙根际土壤微生物與水仙生长发育的关系。【前人研究进展】水仙根际土壤微生物组成与栽培方式、地理位置及水仙的生长习性等密切相关[4]。体外喷施有效微生物群制剂，可显著促进水仙花的生长发育[5]。已有研究证实，大量微生物类群具有促进植物生长的机制。Ryu等[6]从拟南芥根际土壤鉴定出2种菌株，它们释放出的一些挥发性物质极大促进了拟南芥的生长。此外，从芽孢杆菌属、假单胞菌属和黄杆菌属中，分离到多种可增强植物抗病性的促生菌菌株[7-9]。根际土壤微生物也包括可以抑制植物生长甚至导致植株死亡的根际“有害菌，”如根腐病病原菌[1O]、青枯病病原菌[11]等，它们普遍分布在根际土壤环境中，略微积累，就有可能影响根际土壤微生物群落的稳定，产生有害物质，抑制植物根系对土壤养分的吸收，严重可导致植物死亡。根际环境成为土壤一根系一微生物互作的关键区域，被称作植物的第二基因组[12]，根际土壤微生物影响着植物的生长发育，近年来一直是科学家们研究的热点。【本研究切入点】福建省漳州市具有栽培水仙花的得天独厚的地理环境，可提供研究水仙根际土壤微生物群落结构、功能及其与植物互作的理想土壤材料。然而水仙根际土壤菌群结构的组成特征及根际细菌、真菌和古菌的关键微生物类群组成亟待深入探讨。【拟解决的关键问题】采集在漳州培育的漳州水仙根际土壤，利用高通量测序技术，对根际土壤中细菌、真菌和古菌群落的组成进行系统鉴定，分析水仙根际土壤环境中优势的微生物类群，并对其生物功能进行探讨，以期揭示中国水仙根际土壤微生物的群落分布特征，为解析水仙花的环境适应性机制以及建立科学合理的水仙花种植制度提供理论依据。

1材料与方法

1.1根际土壤微生物样品采集

土壤样品于2020年4月25日在福建省漳州市“水仙花海”园区进行漳州水仙金盏银台根际土壤的采集。用5点取样法采集水仙根际土壤，去除土壤表层杂草和凋落物，在水仙植株的根部一侧小心挖掘，待改侧植株根系露出后，用毛刷刷取黏附在根表面的土壤。共采集5处样地的水仙根际土壤，每处样地选择3株植株，每处土样总采样量约为50 g，各样点土壤混匀后，封入灭菌的50 mL离心管，置于冰盒带回实验室。约20 g新鲜土样用于根际土壤核酸样品提取，剩余部分置于通风橱中，静置24h，磨细后过0.25 mm筛，用铝箔纸收集，用于土壤理化性质测定。

1.2土壤理化性质测定

用梅特勒一托利多pH计测定土壤pH;土壤有机质含量采用重铬酸钾（ K2Cr207）法测定[13];土壤的全氮含量采用凯氏定氮法测定[14];采用碱解扩散法[15]、NaHCO，浸提法[16]和醋酸铵浸提一火焰光度法[17]测定土壤碱解氮、有效磷和速效钾含量。采用乙酸铵离心法测定土壤阳离子交换量（ Cation ExchangeCapacity，CEC）[18];用梅特勒一托利多电导率仪测定土壤电导率;采用石墨炉原子吸收光谱法测定土壤中铅（ Pb）含量[19]。

1.3 DNA抽提和PCR扩增

根际土壤微生物DNA样品依据PowerSoil?DNAIsolation kit（ MoBio.U.S.）说明书的操作进行，DNA的质量、浓度和纯度通过1%的琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop2000鉴定;使用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）[20]对16S rRNA基因V3-V4可变区进行PCR扩增;使用524FlOextF（5'-TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3'）和Arch958RmodR（5'-YCCGGCGTTGAVTCCAATT-3，）[21]对古菌16S rRNA基因的特异区间进行PCR扩增;使用SSU0817F（5'-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3 '）和1196R（5'-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3，）[22]对真菌18S rRNA基因的特异区间进行PCR扩增。扩增程序如下：95℃3 nun，35个循环（95℃30 s，58℃30 s，72℃30s），72℃15 min，最后4℃保存（PCR仪：ABI Verity? 96型）。PCR反应体系为：5×TransStart FastPfu 4 uL，2.5 mmol·L-l dNTPs 2 uL，上游引物（5umol·L-l） 0.8uL，下游引物（5 umol·L-I） 0.8 uL，TransStart FastPfuDNA聚合酶0.4 uL，模板DNA 10 ng，使用灭菌双蒸水将体系补足至20 uL。每个样本设置3个重复。

1.4 Illumina Miseq测序

使用2%琼脂糖凝胶分离PCR产物，然后对相应胶条进行切割回收，利用MiniBEST Agarose GelDNA Extraction Kit（ TaKaRa，Japan）进行回收产物纯化，并用QuantusrM Fluorometer（ Promega，USA）对回收产物进行检测定量。建库依据NEXTFLEXRapid DNA-Seq Kit进行，具体步骤如下：①在DNA片段两端连上特定序列的接头;②利用样品本纯化磁珠进行片段筛选;③通过PCR扩增实现原始模板的富集;④将PCR扩增后的文库进行分选回收。采用Illumina Miseq测序技术（上海美吉生物医药科技有限公司）对文库进行高通量测序分析。原始数据上传至NCBI SRA数据库（序列号：SAMA16825444，Genbank登录号：PRJNA679159）。

1.5数据处理

利用Trlmmomatic软件对接头（Adapter）序列和低质量序列进行过滤[23]，使用FLASH软件实现测序数据的质控拼接[24]，具体步骤如下：①去除尾部质量值的读长（ Reads）在20以下的碱基，设置50 bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，去除质控后50 bp以下的读长，去除含N碱基的读长;②根据读长之间的重叠，将成对读长重叠区域连接起来，重叠区长度不低于10 bp;③拼接序列的重叠区碱基错配率不高于0.2;④根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2。使用的UPARSE软件[25]，将序列相似性> 97%的定为一个OTU。用RDP classifierc2627]数据库，选取OTU代表序列跟数据库中的已知序列比对，获得每个OTU的物种注释信息，用Mothur[28]计算不同随机抽样下的Alpha多样性指数，用R语言工具制作曲线图。以OTU丰度为基础，用ACE和Chao指数反映群落物种丰富度，用香农指数和辛普森指数反映群落多样性，同时估测物种均匀度。

2结果与分析

2.1采样地土壤理化特点

漳州位于福建省最南部，气候温暖，年平均气温21℃;雨量充沛，水源充足，土壤松软，是水仙花的理想产地。对漳州圆山区“水仙花海”采样地的理化特性进行分析，采样地单位体积土壤有机质含量为29 g·kg-l，占比3%;土壤全氮含量为1.3 g·kg-l，占比0.13%，达到较高水平，其中速效氮含量丰富，在土壤中的含量为91 mg·kg-l。说明该生产区土壤有机质含量丰富，熟化程度高，水仙生长及采样期间土壤的氮素供应能力较强[29]。此外，采样区土壤质地属黏质土，CEC含量较高，为13.4 cmol（+）·kg-l。土壤铅含量在85 mg·kg-l，符合农业种植土壤标准。

2.2中国水仙根际土壤微生物多样性

由表1可知，测序得到的细菌、真菌和古菌的有效序列分别为3.91万、6.62万和7.04万条。按照序列相似性≥97%归类为1个OTU分类单位的原则，分别得到细菌、真菌和古菌OTU分类单位2 453、109和118个。本次各样品测得的序列均远远大于10 000，说明测序数据量足够大，可以反映样本中微生物多样性的主要信息。从每个土壤样品的OTUs中计算获得微生物群落的a-多样性指数，包括Chao、ACE、辛普森指数和香农指数，以此来反映微生物群落的丰富度和多样性。结果表明，根际土壤环境中，细菌的多样性明显高于真菌和古菌，且细菌门下各类物种的数量接近程度也更高。真菌群落和古菌群落中鉴定到的物种数目、物种数量的相对密度均较为接近，同时明显低于细菌群落。

2.3中国水仙根际土壤细菌群落的组成

利用高通量测序的方法，根据OTU分类学注释结果，按照门和属2个水平提取序列，计算各类物种的相对丰富度。从图1-A可知，在水仙根际土壤细菌群落中系统鉴定到超过40种不同门类的细菌，其中，13个门的细菌丰度总和高于总序列的97%。绿弯菌Chloroflexi（ 30.86%）、变形菌Proteobacteria（20.67%）、放线菌Actinobacteria（ 18.25%）和酸杆菌Acidobacteria（ 13.6g%）是根际土壤细菌群落中的主要门类，总丰度高于总序列的80%。通过属分类层次（图2-A）分析，表明在细菌中占优势的菌属分别为SBR2076、盖勒氏菌属Gaiellales、水恒杆菌属Mizugakiibacter、嗜酸柄热菌属Acidothermus、微球菌属Micrococcales和Variibacter，这6个属类各自的细菌丰度均高于总序列的1%，其他占比较少。属水平上的统计分析表明，水仙根际土壤细菌群落中53.77%以上的细菌属于未知。

2.4中国水仙根际土壤真菌群落的组成

在中国水仙根际土壤中检测到6种不同门类的真菌，真菌门类群大比例集中于子囊菌门Ascomycota，占真菌总序列的84.94%，其他真菌门类所占比例相对较少，分别为担子菌门Basidiomycota（ 9.20%）、毛霉门3.38%、壶菌门Chytridiomycota（ 0.3g%）、芽枝霉门Blastocladiomycota（ 0.05%）和捕虫霉门Zoopagomycota（ 0.04%）（图1-B）。通过属分类层次（图2-B）分析，丰度高于总序列1%的优势真菌属分别为球毛壳菌Chaetomium globosum（ 28.15%）、散子囊菌Eurotiales（ 25.01%）、粪壳菌Sordariomycetes（9.84%）、伞菌Agaricales（ 7.Og%）、锥毛壳属Coniochaeta fodinicola（ 4.52%）、 禾谷镰孢菌Fusarium graminearum（ 3.93%）、葫芦霉Cucurbitariaceae（ 3.2g%）、油脂酵母菌Lipomycesstarkeyi、小囊菌Microascaceae（ 1.88%）和三色霉菌Trimorphomycetaceae（1.24%），其他所占比例较少。

2.5中国水仙根际土壤古菌群落的组成

对水仙根际土壤中古菌群落多样性的分析表明，古菌门类群主要包括奇古菌门Thaumarchaeota（51.40%）、深古菌門Bathyarchaeota（ 25.98%）和广古菌门Euryarchaeota（ 20.65%），3个门的古菌丰度总和高于总序列的98%以上。其他门类，包括洛基古菌门Lokiarchaeota、 谜古菌门Aenigmarchaeota、Parvarchaeota等，所占比例相对较少（图1-C）。通过属分类层次（图2-C）分析，表明在古菌中占优势的菌属主要为来自奇古菌门的SCG（ Soil CrenarchaeoticGroup）类群和嗜酸性氨氧化古菌CandidatusNitrosotalea类群，在古菌总序列的占比分别为25.67%和12.93%，以及来自广古菌门的甲烷杆菌属Methanobacterium（ 8.24%）、 甲烷八叠球菌属Methanosarcina（ 5.67%）、 Rice Cluster I（2.62%）、第七产甲烷古菌属Methanomassiliicoccus（ 1.17%）等。值得注意的是，属水平上的统计分析发现，古菌群落中25.71%以上的序列来自深古菌门里的未知属种。

3讨论

植物根系是多细胞生物与土壤接触的界面。植物根际土壤微生物组成及其分布，与植物的生產和健康密切相关。漳州地理位置特殊，北有高山阻隔寒流入侵，南有海洋调节，自然条件优越，气候温和，雨季集中[30]，花田土壤松软，是我国有名的水仙花主产区，有“天下水仙数漳州”的美誉。笔者以漳州市圆山麓脚下的水仙花种植园作为研究区域，以水仙花根际土壤微生物为研究对象，采用IlluminaMiseq高通量测序技术，实现了对以漳州水仙为代表的中国水仙根际土壤环境中不同微生物类群序列的初步研究。

从细菌群落结构及功能来看，研究发现，中国水仙根际最为优势的细菌为绿弯菌、变形菌、放线菌和酸杆菌，其中，绿弯菌是中国水仙根际细菌群落中的优势菌，占根际土壤细菌的比例约为30%。绿弯菌广泛分布在土壤、海洋等各种环境中，是营养元素循环等生态学过程的重要参与者[31]。Fan等[32]研究表明，土壤绿弯菌与作物产量指示基因呈显著正相关，提出绿弯菌是具有促生作用的土壤关键微生物菌群之一。变形菌也是水仙根际土壤占比较高的细菌群落之一，这与之前植物根际土壤细菌结构组成的研究结果基本一致，例如研究表明变形菌是大豆[33]、玉米[34]、柑橘[35]等常见农作物，以及梭鱼草、美人蕉、红花等观赏植物根际土壤富集的主要菌群'3637]。在细菌属水平的组成上看，可以发现根际土壤环境中占比较高的Mizugakiibacter、Acidothermus、Variibacter等大多数为促生菌，在已有研究中，作物枯萎病[38-39]、青枯病[40]等土传病害发病较轻的土壤中这些类群的占比比较高，可作为水仙根际土壤促生细菌潜在功能菌株。

根际土壤真菌作为根际生态系统中的重要组成，是分解者中的先锋物种，在维持根际生态系统稳定、代谢调节和抗病虫害等方面有重要调节作用[41]。本研究发现，在中国水仙根际土壤真菌种群结构上，80%以上的真菌来自于子囊菌门，其次是担子菌。在世界范围内，土壤真菌群落中几乎均以子囊菌为优势型[42]。在属水平上，本研究中的优势真菌是来自盘菌亚门的球毛壳菌属Chaetomium globosum和散子囊菌属Eurotiales，与世界范围内的土壤真菌调查结果一致[42]。根据Pietro等[43]、Park等[44]研究表明球毛壳菌是一种广谱拮抗性真菌，从该菌发酵液中提取出的代谢活性物质对稻瘟病、小麦叶锈病、番茄晚疫病等多种病原菌有拮抗作用，在生物防治中具有巨大的开发应用潜力。

古菌是地球进化最早期的生命体之一，能适应严寒、酷暑等极端环境，同时驱动着土壤碳、氮、硫等营养元素的生物地球化学循环[45]。本研究中，古菌在土壤微生物群落及生物量亦占有不可忽视的比例。从古菌群落组成来看，古菌序列主要来自奇古菌门，其次来自广古菌门，二者参与了土壤碳、氮和氢的生物地球化学循环。已知奇古菌具有氨氧化、反硝化等多样的生理代谢特性和功能，易繁衍在有机质含量低、含水量较低，即氨态氮含量低的土壤[46]。本研究中，奇古菌SCG类群丰度最高，嗜酸性氨氧化古菌Candidatus Nitrosotalea丰度紧随其后，与Shao等[47]对西北草原古菌群落所做的研究一致。本研究发现，广古菌在水仙根际土壤古菌群落中亦占有相当大的比例，已有研究表明，广古菌的相对丰度随氨态氮的增加会显著增加，而且还与土壤中的可利用硫正相关[48]。研究还发现，来自广古菌门下的产甲烷古菌Methanobacteriu和甲烷八叠球古菌Methanosarcina是中国水仙根际土壤古菌群落丰度占比较高的类群，提示中国水仙种植地也是甲烷释放量较多的土壤类型。其中，产甲烷古‘菌是迄今所知的在严格厌氧条件下生存，并以甲烷为特异代谢产物的古菌群，它们产生的甲烷气体在全球碳循环中起到不可忽视的作用[49]。已知古菌作为最古老的生命体，对不同土壤环境变异的适应能力较强，本研究对水仙花根际土壤微生物中古菌关键种群的鉴定及其丰度的研究，可为土壤古菌的地理分布规律及功能意义提供重要参考。

4结论

综上所述，本研究基于3个不同类型微生物样品：细菌、真菌和古菌，初步揭示了以漳州水仙为代表的中国水仙根际土壤的细菌多样性、真菌多样性以及古菌多样性，尤其是发现了之前未知的水仙根际土壤真菌类群和特有的古菌类群，这些结果将为开发和利用水仙根际土壤微生物资源奠定基础。同时，研究结果对于今后了解水仙微生物群落环境适应性具有重要意义。

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（責任编辑 ：林海清 ）

收稿日期：2021-0328初稿：2021-0521修改稿

作者简介：李媛媛（ 1989-），女，博士，讲师，主要从事环境微生物学研究（E-mail： livuanyuan9215@163 com）

*通信作者：陆銮眉（ 1968-），女，教授，主要从事观赏园艺学研究（E-mail： 358070295@qqcom）

基金项目：福建省科技计划对外合作重点项目（ 201810014）：漳州市自然科学基金项日（222020JlO）;漳州市科技重大专项（222019ZDOl）;闽南

师范大学校长基金项目（ 4206/L21918）