罗汉果土传病害拮抗细菌的筛选及鉴定

王瑞昊 邓业成 陈广桂 张泽 张燕玲 邓志勇 蓝福生 郭丽霞 张川梅 梁保明 骆海玉 张明良

摘要：【目的】從罗汉果根际土壤中筛选分离出对白绢病（southern blight）与根腐病（root rot）有抑制作用的拮抗细菌，为罗汉果土传病害生物防治提供合适菌株。【方法】采用稀释涂布法和划线法从罗汉果果园土壤中分离纯化出拮抗细菌114株。随后对分离出的拮抗细菌采用平板对峙法进行抑菌活性筛选。通过16S rDNA序列分析，结合菌落形态特征，生理生化特征对菌株进行鉴定。【结果】22株细菌对至少1种罗汉果土传病原真菌表现出小同程度的抑制作用。其中5株细菌即TYX-2、TYX-3、TYX-4、TYX-7和TYX-8对根腐病与白绢病抑制作用最为明显，对罗汉果根腐病菌的抑制率分别为67.53%、57.50%、64.17%、60.00%和66.67%。对罗汉果白绢病菌的抑制率分别为83.03%、87.58%、53.3 1%、82.27%和86.67%。经过形态学、生理生化特征以及16S rDNA系统发育树的分析，确定TYX-2、TYX-7和TYX-8为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezia），TYX-3为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），TYX-4为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。贝莱斯芽孢杆菌TYX-2、枯草：芽孢杆菌TYX-3和解淀粉芽孢杆菌TYX-4发酵液对2种罗汉果病原真菌电有较好的抑制作用，对罗汉果根腐病菌的抑菌率分别为47.83%、48.67%和45.83%，对罗汉果白绢病菌的抑菌率分别为5 2.00%、50.42%和55.83%。【结论】分离鉴定出的TYX-2、TYX-3和TYX-4分别为贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，具有较高的生防应用价值，为进一步研制复合生防菌剂，防治罗汉果土传病害奠定理论基础。

关键词：罗汉果;根腐病菌;白绢病菌;分离鉴定;拮抗细菌

中图分类号：S 435

文献标志码：A

文章编号：1008-03 84（ 2021） 080927-09

Antagonistic Bacteria against Soil-borne Diseases on Siraitia grosvenornWANGRuihao 1. DENGYecheng 1*， CHENGuanggui 1， ZHANGZe 1. ZHANGYanling 2， DENGZhiyong 1， LANFusheng 2，GUO Lixia 2. ZHANG Chuanmei 2. LIANGBaoming 2， LUO Haiyu 1， ZHANGMingliang 2（I. College of Life Sciences， Guangxi Normal University. Guilin， Guangxi 54 1004， China;2. Guilin GFS Monk Fruit Crop， Guilin， Guangxi 541006. China ）

Abstract： 【Object】Microbes with potential of being used as biological control agents against the southern blight and rootrot diseases on Siraitia grosvenorii were screened and identified from the thizosphere soil in the field. 【Method】A total of114 strains of presumably antagonistic microorganisms were isolated from the soil at a S. grosvenorii orchard by means ofdilution coating and streaking. The isolates were screened for their antibacterial activity using the plate confrontation method.and subsequently， identified by 16S rDNA sequence analysis along with observations on the colony morphology and microbialphysiochemical characteristics. 【Result】Twenty-two isolated strains displayed varying degrees of inhibition effect on one orboth root rot and southern blight pathogens. They included the bacteria under the coded names of TYX-2. TYX-3. TYX-4.TYX-7. and TYX-8 with inhibition rates on the root rot of 67. 53 %， 57.50%. 64.17%， 60.00%. and 66.67%， respectively， and onthe southern blight with the rates of 83.03%. 87.58%. 53.3 1%. 82.27%， and 86.67%， respectively. TYX-2， TYX-7. and TYX-8were identified to be Bacillus velezia. TYX-3 B. subtilis. and TYX-4 B. amyloliquefaciens. The fermentation broths of TYX-2.TYX-3， and TYX-4 also showed significant inhibition rates on the root rot pathogen at 47.83%. 48.67%. and 45.83%.respectively， and 52.00%. 50.42%. and 55.83% on the southem blight. 【Conclusion】 The isolated B. velez， B. subtilis'. and B.amyloliquefaciens strains displayed significant inhibitory effects on the root rot and southern blight of S. grosvenorii. Theycould be studied further for a potential application as agents for biocontrol on the diseases.

Key words： Siraitia grosvenorii; root rot; southern blight; isolation and identification： biocontrol bacteria

0 引言

【研究意義】罗汉果Siraitia grosvenorii （Swingle）C.Jeffrey为葫芦科Cucurbitaceae罗汉果属Siraitia多年生草质藤本宿根植物，又名汉果、长寿果、神仙果，是我国特有甜料及珍贵药用植物。罗汉果果实富含人体所需的多种氨基酸、维生素及多种糖类物质，具有清心润肺、止咳消喘、清热解毒、润肠通便、祛痰补血、益肝、健脾、镇静及降压等功效，已被广泛应用于医药、保健品、饮料和调味品等领域[1]。罗汉果的药用部位不仅是果实，根和叶也可入药，对治疗消化系统疾病，降低血压功效显著;罗汉果甜素具有甜度高，不含热量，无毒等优点，符合目前食品市场对低热量甜味剂的需求，在保健食品领域发展前景广阔[2]。但以白绢病、根腐病为主的罗汉果土传病害严重影响果实产量。仅2003 2005年桂林罗汉果种植区因病害死亡共计234789株，经济损失达586.97万元。白绢病病菌能危害100多科的500多种植物，主要通过侵染植物幼苗近地面的根茎部发病[3]，发病植株根部产生白色菌丝持续蔓延，在后期可形成褐色菌核。罗汉果根腐病发病症状表现在地上、地下2个部分。地下部分：须根少并完全腐烂，主根呈黑色逐渐腐烂。地上部分：植株矮小，底叶变黄枯落，最后整株叶片萎蔫、枯死[4]。土传根系病害发生除与病原菌有关外，还常伴随根际土壤微生物区系异常，有害微生物数量增加，有益微生物数量减少，严重影响植物健康[5]。因此，如何全面有效地防治这类土传病害已经成为植物生产上的当务之急。【前人研究进展】拮抗菌的筛选鉴定是植物生物防治中的关键环节。有研究表明从健康草莓根际土壤中分离出的多粘类芽孢杆菌可使草莓根腐病菌尖孢镰刀菌菌丝畸形生长[6]。Sid Ahmed等[7]从甜椒根基组织中分离出4株芽孢杆菌，可有效降低疫霉菌侵害，与对照组相比根系腐烂情况降低80%。季倩茹等[8]将巨大芽孢杆菌B213、多粘类芽孢杆菌B207和枯草芽孢杆菌B204 3种芽孢杆菌联合施用后在盆栽实验中可有效抑制黄瓜枯萎病的发生。这些研究结果表明从植物根系土壤中分离鉴定的拮抗菌具有良好的生防效果，在生物防治中发挥重要作用。【本研究切入点】目前生防微生物的研究多集中在辣椒、草莓等大面积种植的作物，对罗汉果土传病害拮抗菌的研究较少，因此本研究从健康罗汉果根系土壤中分离纯化拮抗细菌，对其进行抑菌效果测定，对效果较好的菌株进行鉴定并探究其发酵产物活性。【拟解决的关键问题】筛选出的拮抗菌株，进一步开展利用拮抗微生物防治罗汉果土传病害的研究，旨在探讨有效的罗汉果土传病害绿色防控新技术，解决目前该类病害危害严重、防治困难以及因化学防治造成的罗汉果产品农药残留问题，为罗汉果产业的健康可持续发展提供有效的技术支持。

1材料与方法

1.1材料与试剂

病原菌：腐皮镰孢菌（Fusarium solani），罗耳阿太菌（Athelia rolfsii）均从桂林市临桂区罗汉果种植园内采集具有罗汉果根腐病与白绢病典型症状的病株中分离得到。

拮抗细菌：从桂林市临桂区罗汉果种植园内健康罗汉果根际土壤中分离得到。

LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，去离子水1000 mL，pH 7.0。

LB固体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，琼脂20 g，用去离子水定容至1000 mL，pH 7.0。

牛肉膏蛋白胨培养基（NA）：牛肉膏3 9，蛋白胨10 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0。

PDA培养基：马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂20 g，水1000 mL，pH自然。

1.2试验仪器

主要仪器：超净工作台ZHJH-C1112C，上海智城;恒温培养箱，韶关泰宏医疗器械;恒温摇床LY2-2102C，上海龙跃;紫外可见光分光光度计UV-1200，上海美普达。

1.3试验方法

1.3.1土壤拮抗细菌的分离 选取自然状态下生长较为粗壮的罗汉果苗，缓慢抖落根部土壤后取附着在根际表面的土壤，参考柳慧丽[9]的方法，将10 g健康罗汉果根际土壤样品放入装有90 mL无菌水的250 mL灭菌三角瓶中，将三角瓶置于37℃，200r·mm_1摇床振荡20 min，使之充分悬浮后在80℃水浴条件下加热10 min后用无菌水稀释至10-3、10-4、10-5、10 6等4个浓度梯度。分别吸取100 uL土壤悬液用涂布法接于牛肉膏培养基上，每种浓度梯度重复3次，置于30℃培养箱培养24-48 h，定时观察并挑取单菌落进行平板划线纯化。将平板置于4℃冰箱内保存。

1.3.2土壤拮抗细菌对罗汉果土传病原真菌的抑菌活性测定 采用平板对峙法测定土壤细菌对罗汉果根腐病菌和白绢病菌的抑菌活性。在无菌操作台内用直径为4 mm的打孔器在恒温28℃，培养3d的病原菌落边缘打孔，用无菌接种针将菌饼接于PDA平板中央，同时在病原菌两侧2.5 cm处用接种环取分离菌株划线，对照组只接病原菌而不接种拮抗细菌（ CK）。每个处理重复3次。28℃恒温培养，培养7d后测量病原真菌菌落半径，计算抑菌率[1O]。

抑菌率/% -[（对照菌落半径处理菌落短半径）/（对照菌落半径0.2 cm）]×100

1.3.3拮抗菌株鉴定 形态观察：将活化后的菌株用划线法接入平板，30℃培养24h，观察菌落的生长情况、颜色和形态特征。生理生化检测：将筛选的拮抗菌于LB液体培养基30℃培养24h后用于生理生化的测定，测定指标包括革兰氏染色、VP（ Voges-Proskauer）实验、接触酶实验、吲哚产生实验、明胶液化实验、甲基红实验、阿拉伯糖发酵实验、甘露醇发酵实验、麦芽糖发酵实验、木糖发酵实验、葡萄糖发酵实验、蔗糖发酵实验。具体方法参照《常见细菌系统鉴定手册》[11]。分子鉴定：采用细菌通用物27f： AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和1492R： TACGGYTACCTTGTTACGACTT对其进行PCR扩增。反应体系30 uL。PCR扩增反应条件为95℃5 min. 95℃30 s，55℃30 s，72℃1min，35个循环，72℃10 min，12℃终止反应。送至北京六合华大基因科技有限公司武汉分公司进行检测纯化及测序。登录NCBI网站（www.ncbi.nlm.nih.gov）利用Blast软件将获得基因序列与GenB ank中已知的序列进行同源性比对分析，选择同源性相近的序列进行系统进化分析，序列先进行多重比对，然后用MEGA6软件采用邻接法（Kimura's 2-parameter模型，bootstrap 1000）构建系统发育树，明确拮抗菌株的系统发育学地位。

1.3.4拮抗细菌发酵产物对罗汉果土传病原真菌的抑菌活性测定 以在1.3.2中抑菌效果较好的拮抗细菌作为复筛菌株。将NA培养基上活化好的拮抗细菌接于装有NA液体培养基200 mL/500 mL三角瓶中，在温度为28℃，转速为160 r·min-1的摇床中振荡培养24 h，在无菌操作台中用微孔无菌滤膜过滤后备用。采用滤纸片法测定发酵产物对罗汉果土传病原真菌的抑菌活性：在直径为9cm的培养皿中倒入10mLPDA培养基，在平板中心放入滴加4 uL拮抗细菌滤液的滤纸片（直径为6 mm），在滤纸片两边2.5 cm处放入用打孔器打取的病原真菌（直径为4mm），以只接无菌水的滤纸片组为对照，每个处理3个重复，置于28℃培养箱中培养，定时观察，待对照组菌落长至滤纸片边缘时测量菌落半径（处理菌落测量生长短半径），按1.3.2中的公式计算抑菌率。

2结果与分析

2.1土壤拮抗细菌的分离

通过稀释涂布与划线法分离纯化细菌菌株，共从罗汉果根际土壤中共分离出细菌144株，其中有拮抗活性的22株，编号分别为TYX一1至TYX一22。

2.2土壤细菌对罗汉果土传病原真菌的拮抗活性

由表1與图1可知TYX一2、TYX一3、TYX一4、TYX一7、TYX一8对2种病原菌均有较强的抑制作用，抑制率均在50%以上，其中TYX一2对根腐病的抑菌效果最好，达67.53%，对白绢病病抑制效果最好的为TYX一3，达87.58%。

2.3拮抗菌株鉴定

2.3.1拮抗菌株的形态特征与生理生化特征 根据筛选出的5株效果较好的生防细菌进行形态学鉴定，将分纯后的生防菌平板用接种环取1/5环用划线法接入牛肉膏固体培养基中，在30℃培养48h后结果如表2与图2所示，在平板上观察到TYX一4菌株表面粗糙，呈网形菌落，稍有淡黄色，TYX一3菌株菌落呈不规则圆形，表面干燥，菌落呈乳白色;TYX一2、TYX一8、TYX一7等3株菌株生长速度较快，菌落呈乳白色规则圆形，表面湿润黏稠。通过形态学初步观察，除TYX一4菌株在生长速度、颜色、菌落表面有细微差异外，5种生防细菌在形态方面相似，初步判断5种生防细菌为同属。生理生化鉴定结果由表3可知，根据常见细菌鉴定手册检索初步鉴定TYX一3为枯草芽孢杆菌，TYX一4为解淀粉芽孢杆菌，TYX一2、TYX一8、TYX一7等3株皆为贝莱斯芽孢杆菌。

2.3.2拮抗菌株的16S rDNA测序结果 将5株细菌的16S rDNA分子鉴定结果经过MEGA6.0软件对相近序列构建系统发育树后发现，菌株TYX一2（登录号MW019947）经过BLAST对比后显示与编号为MT626060.1的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezia）相似度为99.91%（图3）。菌株TYX一3（登录号MW019964）经过BLAST对比后显示与编号为KP184705.1的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）相似度高达99.69%（图4）。菌株TYX-4（登录号MW019964）经过BLAST对比后显示与编号为KF836523.1的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amiyloliquefaciens）相似度达到100%（图5）。TYX-7与编号为MT645702.1159-1283的贝莱斯芽孢杆菌相似度达到99.92%（图6），TYX-8与编号为CP054714.1的贝莱斯芽孢杆菌相似度达l00%（图7）。确定了TYX-3为枯草芽孢杆菌，TYX-4为解淀粉芽孢杆菌，TYX-2、TYX-8、TYX-7均为贝莱斯芽孢杆菌。

2.4拮抗细菌发酵产物对罗汉果土传病原真菌的抑菌活性

筛选出对罗汉果根腐病与白绢病均有抑制作用且不同种的3种生防细菌TYX-2、TYX-3、TYX-4进行发酵产物抑菌活性试验。由表4与图8可知，3种生防菌发酵产物对2种病原菌都有较好的抑制作用，对白绢病菌抑制率分别为52.00%、50.42%、55.83%，对根腐病菌抑制率分别为47.83%、48.67%、45.83%。其中TYX-4发酵产物对白绢病的抑制作用最好，达55.83%。试验结果表明3种细菌生防发酵产物能够有效防治罗汉果土传病害，在生物防治中有一定潜力。

3讨论与结论

现阶段对土传病害的防治主要从物理、化学、生物3个方面进行。如物理防治方面，多采用轮作，太阳光消毒，换土等方法防治植物茎腐病。在化学防治方面，任凤山等[12]筛选出70%恶霉灵与70%甲基硫菌灵可湿粉剂组合防治番茄茎腐病效果最佳，达95.57%。生物防治方面，高琳娜等[13]利用枯草芽孢杆菌发酵液进行灌根后对板蓝根根腐病防治效果达到72.97%，防效明显的同时还具有一定的增产作用。目前，绝大部分化学药剂和抗病品种只针对少数的土传病害有效，对多数病害防效甚微，且土壤施入农药时除农药易被土壤吸附固定，被土壤微生物降解降低防效，用药量大、效果差外，长期使用极易引起农药残留、环境污染、植物毒性以及病原菌的抗药性等问题[14]。生物防治由于克服了上述弊病，且大量的研究和实践证明其对大部分土传病害防治方面效果显著[15]。芽孢杆菌作为近年来开发应用最为成功的生防菌剂具有易获得，价格低廉，抗逆性强，人畜无害等特点，有研究表明芽孢杆菌产生的抗菌物质已成功应用在生物防治领域[16]。但目前有关罗汉果土传病害生物防治的研究较少，本研究从罗汉果根际土壤中分离筛选chu 5株对罗汉果土传病害有抑制效果较好的生防细菌，经菌株形态、生理生化特性和16S rDNA分子生物学鉴定，确定了TYX-2、TYX-7、TYX-8为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillusvelezia）、TYX-3为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、TYX-4为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。其中TYX-2对罗汉果根腐病抑菌效果最好，达67.5 3%。TYX-3对白绢病抑制效果最好，达87.58%。菌株TYX-2、TYX-3、TYX-4均是有较好应用前景的生防菌株，为后续深入研究3株生防菌混合制成生防菌剂奠定理论基础。

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（责任编辑：林海清）

收稿日期：2021-0201初稿;2021-0503修改稿

作者簡介：王瑞吴（ 1995-），男，硕士生，主要从事天然产物研究（E-mail： 429567099@qq.com）

*通信作者：邓业成（ 1965-），男，博士，教授，主要从事天然产物及植物保护研究（E-mail： dyecheng@163.com）

基金项目：广西重点研发计划项目（桂科ABl850025）：桂林市重点研发计划项目（20190211—19）