米卡芬净中间体FR901379的分离纯化技术研究

2021-11-15 05:10朱海荀顺义刘庆单继军博瑞生物医药泰兴市有限公司江苏泰州225400
化工管理 2021年30期
关键词:米卡中间体脱色

朱海,荀顺义,刘庆,单继军(博瑞生物医药泰兴市有限公司,江苏 泰州 225400)

0 引言

采用分离纯化技术能够较为快速地实现物质成分分解,切实提高药物活性。但是分离纯化技术的应用成本和技术要求较高,而不同的分离纯化技术具有不同的应用特点,具体应用效果也存在差别,较为常见的分离纯化技术包括高效液相色谱、亲和色谱。

1 米卡芬净

米卡芬净作为一种新型抗真菌药,最早于2002年日本开始上市,米卡芬净作用机制独特,本身并无肾毒性,和其他药物一起彼此之间并不会发生相互作用,因而被广泛应用于治疗危重患者侵袭性真菌病。自2005年美国 FDA 审批通过后,米卡芬净的耐药性备受关注。而米卡芬净在临床应用中,对热带念珠菌、杜氏念珠菌、白念珠菌均具有较好的抗菌效果。米卡芬净属于半合成抗菌药,中间体FR901379是合成该药物的关键材料,对中间体FR901379进行微生物转化切除,再通过化学合成反应,与活性侧链结合,即可获得米卡芬净。在米卡芬净中间体FR901379的制备中,表现出流程复杂、使用材料多的特点,分离纯化难度较高,难以实现中间体FR901379的量化生产,影响米卡芬净的推广应用。基于叠缩工艺原理,本试验主要运用大孔树脂,从而直接完成发酵液产物的分离、富集工作,并通过使用相应溶剂完成结晶分散,从而获取得到高浓度的提取液,切实完成生物转化,满足生产需求,用于工业化生产。在试验中,通过高效纯化措施,将中间体FR901379转变为米卡芬净的高纯度母核FR179642,以此为米卡芬净的高效生产提供高质量原材料。

2 分离纯化

分离纯化试验应用仪器包括高效液相色谱仪、水环真空泵及旋转蒸发器;应用材料包括中间体FR901379发酵液、大孔树脂(型号为D312、LX-18、HZ816、LX-20等)、乙腈等。

2.1 色谱条件

事实上,色谱条件也将会直接影响到试验分析结构,对于本次试验,流动相则采用乙腈∶4 g/L乙酸铵溶液 (47∶53),将流速控制在1.0 mL/min左右,而整个色谱柱则选择为Inertsil C 18 柱 (4.6 mm×250 mm,5 m),柱温始终保持在大约40 ℃[1]。如果温度过低,将会促使流动相的粘度增加,影响后续试验工作的展开。色谱柱的进样量为10 μL,将色谱检测波长设置为220 nm。

2.2 大孔树脂的预处理

大孔树脂是一种应用较为广泛的有机高分子聚合物,具有液体吸附的功能,常温状态下理化性质较为稳定,但一旦将其处于可吸收溶剂很容易出现膨胀现象。大孔树脂的使用类别多样,当技术人员展开预处理工作时,便需要准备好各种型号的树脂,将其放置到乙醇中进行浸泡,浸泡时间大约24 h。通过浸泡,可以直接通过乙醇的作用,将大孔树脂中的各种杂质、色素去除。之后,再将其放置到去离子水中,添加乙醇进行洗涤,直到整个溶液并无白色浑浊现象出现,则表示大孔树脂清理干净。最后还需要先后将其放置到盐酸溶液、氢氧化钠溶液调节酸碱度。需要注意的是,整个酸碱度调节过程,盐酸和氢氧化钠均为规格2 mol/L、含量3倍树脂体积、浸泡时长4 h。

2.3 发酵液预处理

发酵液经过减压、抽滤,获取得到菌丝体,并在其中添加工业乙醇进行充分搅拌,浸泡时长为2 h,从而抽滤获取得到浸提液。需要注意的是,由于提取乙醇自身浓度较高,并不利于后续展开树脂吸附工作,这就需要工作人员能够在发酵液中添加一定含量的去离子水进行调节,等到浸提液乙醇浓度处于40%左右后便可以完成整个发酵液的预处理工作。

2.4 树脂静态筛选

整个处理环节,可以将5 mL的树脂放置到锥形瓶中,添加浸提液进行震荡,从而达到吸附饱和的作用,进行浓度计算。过滤阶段,将树脂防治到锥形瓶中,添加100 mL的80%乙醇溶液,在室温环境下进行充分震荡,解吸4 h左右,从而完成解吸率的计算。其中,静态饱和吸附量可以通过以下公式计算:

式中:c0为米卡芬净中间体FR901379浸提液的起始浓度;ce为上清液中米卡芬净中间体FR901379浓度;c1为解吸液中米卡芬净中间体FR901379浓度;V0、Vt、V1则分别为浸提液体积、解吸液体积、吸附树脂湿体积。

根据具体计算可以发现,对于不同类型树脂的静态饱和吸附量和解析率都存在差别,以D303为例,吸余液颜色为浅黄色,静态饱和吸附量为0.6 mg/mL,解吸率达到49.8%,具有较为明显的色素杂质吸附作用,可以用于当做脱色树脂。

2.5 脱色树脂的动态筛选

对于脱色树脂的动态筛选,则可以选择应用自身脱色效果较好的树脂D303、HZ801,将其放置到具体规格为100 mL的玻璃柱中,并将流速控制在2 BV/h,从而将含 40%乙醇的浸提液上柱,进行流穿液的收集,对流穿液颜色进行对比,从而判断树脂脱色效果。结果表明,对于D303 树脂,当流穿液处于 40 BV时,整体脱色效果较好,而当处于50 BV时,颜色将会再次变成黄色,到了80 BV,脱色效果最差,树脂呈现为褐色。

2.6 树脂的动态吸附试验

2.6.1 动态吸附

对于已经经过前期处理的 LX-18 树脂,可以直接将其放置到规格为100 mL的玻璃柱中,并将米卡芬净中间体FR901379脱色液直接进行上柱动态吸附,整体流速需要控制在2 BV/h,从而结合流出液信息,获取LX-18 树脂的动态吸附情况。通常而言,对于前10 BV的流出液,可以直接按照集中收集的原则进行装瓶,后10 BV的流出液,则可以按照单独收集的原则,每1 BV流出液就需要将其单独装入到一个玻璃瓶。进而测定浓度,从而发现,当对浓度处于0.8 mg/mL 的米卡芬净中间体FR901379脱色液展开动态吸附,流出液上样量达到 15 BV,整体开始出现泄漏情况,而当流出液上样量达到18 BV,流出液浓度和上样液浓度基本趋同,表明树脂动态吸附处于饱和状态。

2.6.2 吸附流速

将已经经过前期预处理的 LX-18 树脂再分别装入到5个玻璃柱中,玻璃柱容积为100 mL。从而将动态筛选中获取得到的米卡芬净中间体FR901379脱色液上样吸附,并将5根玻璃柱设置为不同的流速,按照每200 mL的含量,进行流出液的收集,进而检测浓度,计算泄漏率,获取最佳吸附流速[2]。

结果根据试验表明,随着上柱流速的提高,泄漏率也会相应提高,随着上柱流速的下降,泄漏率也会相应降低,进而达到理想的吸附效果。事实上,对于米卡芬净中间体FR901379,整个树脂吸附过程均可以被看做是一个稳态过程,所以无论溶质在怎样的环境完成扩散和吸附,均需要相应的传质时间,速度则变成把控吸附率的重要因素。需要注意的是,随着降低上柱流速能够降低泄漏率,但当流速过慢时,也会严重影响整个生产周期,促使杂质增加,起到适得其反的效果。一般来讲,可以将吸附流速控制在 1.5 ~ 2 BV/h范围内。

2.6.3 吸附条件

同时选择 D303 树脂柱、 LX-18 树脂柱,具体规格为50 mL、100 mL,将二者串联,将流速控制在2 BV/h,从而完成上样吸附。当出口浓度约为上样浓度的10%左右,则初步判断树脂吸附已达到饱和状态。按照2 BV/h的流速,用水将树脂柱清洗干净,特别是残留料液,避免料液影响整个解吸效果。

之后,直接断开D303 树脂柱,并通过不同浓度的乙醇溶液进行LX-18树脂柱的吸附,解吸流速控制在0.5 BV/h,从而按照分瓶收集的原则进行解吸液收集。应用 HPLC 法,并将所有浓度超过 0.2 mg/mL 的解吸液进行综合处理,完成解吸率的计算。通过计算发现,当乙醇浓度为40%时,就可以将树脂柱中多余色素清理干净,但是清理效果有限;当乙醇浓度为60%时,解吸率达到71.5%,但是色素清理效果一般;当乙醇浓度为70%时,解吸率为85.7%,拖尾严重,当乙醇浓度为80%时,HPLC纯度达到80.2%,解吸率为93.1%,整体解吸效果最好[3]。

2.7 选择结晶溶剂

在解吸处理后,对溶液进行减压浓缩处理,直到溶液浓缩为固体;再使用200 mg/mL 的80%乙醇溶液溶解固体,将溶液浓度划分为3份,并分别添加异丙醚析晶、乙酸乙酯、丙酮,添加量为溶解液的8~10倍体积,将洁净液冷却放置24 h,要求冷却温度控制在2~8 ℃,冷却后进行抽滤干燥处理,可获得中间体FR901379的粗粉产品,通过HPLC法进行产品浓度检测,从而发现将丙酮作为分散结晶的溶剂结晶收率较好,为81.4%,异丙醚析晶的结晶收率为70.2%,乙酸乙酯的结晶收率为66.3%,均低于丙酮。

2.8 试验验证

基于上述试验获取得到的分离纯化条件,对吸附树脂 LX-18 分瓶展开工艺验证,设置三种不同浓度的浸提液与解吸液,从而检测发现,提取总收率始终大于70%,能够完成理想的分离纯化生产效果。就此,在米卡芬净生产中,可利用叠缩工艺进行中间体FR901379的分离纯化,提高中间体FR901379的总收率,实现米卡芬净生产的降本增效目的,可在实际生产中推广普及。

3 结语

综上所述,对米卡芬净中间体FR901379的分离纯化技术展开分析具有至关重要的意义。通过试验发现,选择浓度80%的乙醇、丙酮分别作解吸剂、结晶溶剂,并将吸附流速控制在1.5 ~ 2 BV/h范围,能够取得理想的分离纯化效果。

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