王文亮,郭佳(宁夏泰益欣生物科技有限公司,宁夏 银川 750205)
阿维菌素是一个十六元环内酯与一个二齐墩果糖结合生成的大环内酯类抗生素,因其具有广谱、高效和低毒的杀虫效果,在国内农业及医药行业具有广阔的应用前景,同时,也是我国主要的出口产品之一,在国外市场中也占据重要的地位。阿维菌素的发酵产物具有8种同分异构体,其中以B1a的抗菌杀虫效果最佳[1]。近年来,阿维菌素的研究较为广泛,涉及到阿维菌素高产菌种的选育、发酵工艺的优化及阿维菌素生物合成过程控制等研究,传统的育种或工艺优化已难以满足企业提升阿维菌素发酵产量需求,但阿维菌素生物合成过程中前体物质的添加将是一个研究热点[2]。
阿维菌素是由链霉菌中阿佛曼菌(Streptomyces avermitilis) 发酵产生大环内脂类化合物。1975年,日本Kitasato Institute (北里大学)大村智教授研究土壤微生物时,分离获得一株阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis MA-4680),研究其活性发现该菌株的发酵液具有杀虫、杀螨、杀线虫、驱肠道寄生虫的活性,且对哺乳动物的毒性较低,即使将发酵液浓缩后,药物的浓度提升为原来的8倍,也无至毒效果[4]。1976年美国Merck公司经对阿维菌素发酵液研究,分离获得一组十六元大环内酯类化合物,将它命名为Avermectin,中文名阿维菌素、或称阿弗菌素或埃维菌素。阿维菌素的发现及应用是继青霉素以来抗生素科学对人类的又一巨大贡献,对全世界的农牧业生产起到了巨大的促进作用[3]。
其生物合成是以乙酸、丙酸等简单有机化合物开始的,目前,已有报道显示缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸及丙酸钠等物质均为阿维菌素合成过程中重要的前体物质。刘钇君等将丙酸钠和异亮氨酸添加至阿维菌素发酵瓶培养基中,结果显示两种添加物均不利于阿维菌素的生物合成,并且对阿维菌素发酵液的pH和菌浓均产生了一定影响。吴晖等研究发现丙酸钠比乙酸钠更适合作为阿维菌素合成的前体物质,有利于提升阿维菌素的生产能力[5]。因此本研究主要考察缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸等氨基酸对阿维菌素发酵产量的影响。
YP4002电子天平(上海越平科学仪器有限公司),XDW25摇瓶机(江苏同君仪器科技有限公司),waters2487型HPLC(江苏塞恩斯科技有限公司)。
黄豆饼粉、玉米淀粉(宁夏泰益欣生物科技有限公司),缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸(河南冠琪生物科技有限公司),硫酸铵、碳酸钙、氯化钴、硫酸锰、钼酸钠(天津市凯通化学试剂有限公司,化学纯)。
本试验菌种阿弗曼菌(Streptomyces avermitilis),由宁夏泰益欣生物科技有限公司提供。
2.2.1 溶液配制
称取一定量的化学纯缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸置于烧杯中加入少量的纯化水,水浴加热用纯化水进行溶解阿维菌素的发酵培养。
2.2.2 阿维菌素含量测定
采用HPLC法测定发酵液中阿维菌素的含量,条件为:C18色谱柱(4.6×150 mm,5 μm),流速1.0 mL/min,检测波长246 nm,流动相为甲醇∶水=9∶1。
大环内脂类抗生素的合成一般都是由一些氨基酸作为前体物质进行合成的,因此加入一定量的前体物质有助于产物的合成,本研究在发酵培养基中添加三种10 mmol/ L 前体物质缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸,与不加任何前体物质的普通培养基对照培养,然后用同一瓶种子液转发酵,在适宜的条件下进行培养11 d后测定阿维菌素发酵单位。
如图1所示,三种前体物质的添加均对阿维菌素发酵单位均有一定的影响,能提升阿维菌素的发酵单位,添加10 mmol/ L 的前体物质,分别高于对照3.89%、2.47%和1.29%。因此,这三种氨基酸对阿维菌素具有提升化学效价的作用。
图1 三种氨基酸对阿维菌素生物合成的影响
在阿维菌素发酵摇瓶培养基中添加不同浓度的氨基酸,将3中氨基酸配制成不同浓度的水溶液,分别在发酵培养基 中 添 加0 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L、60 mmol/L、80 mmol/L浓度的氨基酸,培养11 d后取样测定阿维菌素的化学效价,结果如图2所示。
图2 不同氨基酸在不同浓度下对阿维菌素发酵单位的影响
从上图中可以看出缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸对阿维菌素的生物合成均具有不同程度的影响,其中缬氨酸和亮氨酸对阿维菌素的发酵单位具有积极的影响,不同浓度下实验组的发酵单位高于对照组;添加浓度为10 mmol/L时三种氨基酸的实验组均高于对照。但添加浓度提升20 mmol/L时异亮氨酸就对阿维菌素的生物合成产生了抑制作用;缬氨酸对阿维菌素的生物合成影响最大,当缬氨酸的添加浓度为20 mmol/L时,化学效价达到了峰值为7 200 u/mL左右,高出对照组400个效价单位。表明缬氨酸和低浓度的亮氨酸可作为前体物质进行添加,从而提升化学效价单位。
经过以上对氨基酸浓度及种类进行筛选,确定出缬氨酸在20 mmol/L的浓度下对阿维菌素的发酵单位具有较好的影响,而亮氨酸在30 mmol/L时对阿维菌素的生物合成具有较大的影响,分别配制缬氨酸20 mmol/L和亮氨酸30 mmol/L的浓度,发酵瓶培养过程中每隔24 h测定发酵瓶前中期的pH、菌浓和发酵效价单位。
如图3所示,在配制培养基的过程中添加一定浓度的缬氨酸和亮氨酸,在发酵培养前期对阿维菌素的生物合成具有一定影响,添加缬氨酸后可以有效提升阿维菌素的发酵单位,高于对照组500个效价单位;添加亮氨酸后,在120 h前实验组的发酵效价高于对照组,随着培养周期的延长,实验组的化学效价涨幅下降,最终发酵效价低于对照组。表明亮氨酸对阿维菌素的前期合成具有促进作用,而缬氨酸对阿维菌素发酵效价具有明显的提升作用。
图3 氨基酸度不同周期发酵液的影响
本研究以缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸作为添加前体物质,添加至阿维菌素的发酵培养基中,考察这三种氨基酸对阿维菌素发酵单位的影响,结果表明,缬氨酸可以有效提升阿维菌素的发酵效价单位;异亮氨酸在阿维菌素发酵前期对阿维菌素的合成无明显影响;而亮氨酸在阿维菌素前期的生物合成中具有促进作用,后期培养过程中导致阿维菌素效价单位低于对照组,具体原因需进一步研究。