基于多指标成分同时测定的十七味大活血胶囊溶出行为比较研究

朱应成，徐斌，刘亮镜，余静

芜湖市中医医院制剂中心，安徽 芜湖 241000

溶出度是指固体药物制剂在规定溶剂中溶出的速度和程度。中药口服固体制剂的溶出度与药物的质量优劣、生产工艺等因素密切相关[1]，体外溶出度试验已成为评价固体制剂内在品质的重要手段[2]，合理的溶出度试验可有效反映制剂的内在品质[3]。目前中药固体制剂的溶出度研究报道较少，可能与中药制剂组方药味多、成分复杂、作用途径尚不明确等监控难点有关。

十七味大活血胶囊（皖药制字Z20050027）是芜湖市中医医院院内制剂，由协定处方大活血Ⅰ号方开发而成，具有活血化瘀、消肿止痛功效。该制剂由丹参、赤芍、牡丹皮、红花、延胡索、大黄等17味中药组成，主要用于治疗骨伤初期及手术后肢体肿胀、疼痛等。前期研究建立的十七味大活血胶囊质量标准中含量测定指标较少，且无溶出度检查项[4]。本研究增加含量检测指标，运用HPLC同时测定十七味大活血胶囊中芍药苷、丹酚酸B、丹皮酚的含量，并在中药丸剂溶出度相关研究[5]基础上，对比十七味大活血胶囊中3个指标成分在纯化水、人工胃液、人工肠液3种不同溶出介质中的体外溶出情况，采用相似因子法比较相同活性成分在不同溶出介质中的溶出度，及不同成分在同一溶出介质中的溶出度，并采用自定义加权系数整合模型评价十七味大活血胶囊在不同溶出介质中的整体溶出情况，从一定程度上预测该制剂的体内溶出情况，提高和完善其质量标准。

1 仪器与试药

Agilent1200型高效液相色谱仪（含UV检测器，美国安捷伦公司），XP-205、AL-204型电子分析天平（十万分之一、万分之一，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司），KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），RCZ-8M型溶出试验仪（天津市天大天发科技有限公司）。

十七味大活血胶囊（自制，批号分别为20201101、20201102、20201201）；对照品芍药苷（批号110753-201314）、丹酚酸B（批号111562-201212）、丹皮酚（批号110821-201112），中国食品药品检定研究院，纯度均不小于95%；胃蛋白酶（批号20151201，酶活力≥3 000 U/g）、胰蛋白酶（批号20151201，酶活力≥1 000 U/g），上海展云化工有限公司；甲醇、乙腈和甲酸为色谱纯；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 芍药苷、丹酚酸B、丹皮酚含量测定

2.1.1 色谱条件

采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，10%A；10～25 min，10%～20%A；25～40 min，20%～28%A；40～50 min，28%～50%A），流速1.0 mL/min，检测波长分别为芍药苷230 nm（0～22 min）、丹酚酸B 286 nm（22～40 min）、丹皮酚274 nm（40～50 min），进样量10 μL，柱温20 ℃。

2.1.2 溶液制备

2.1.2.1 对照品溶液

精密称取芍药苷、丹酚酸B、丹皮酚对照品适量，分别加甲醇溶解并制成浓度为310.8、438.1、1 023.0 µg/mL的对照品贮备液；分别取芍药苷、丹酚酸B、丹皮酚对照品贮备液4、3、1 mL共同置于10 mL容量瓶，加甲醇稀释，得到芍药苷、丹酚酸B、丹皮酚浓度分别为124.32、131.43、102.30 µg/mL的混合对照品溶液。

2.1.2.2 供试品溶液

取十七味大活血胶囊内容物适量，研细，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定质量，超声（功率350 W，频率40 kHz）处理30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.1.2.3 阴性对照溶液

按十七味大活血胶囊处方和制备工艺，制备不含赤芍、丹参、牡丹皮的阴性样品，按“2.1.2.2”项下方法制备，即得。

2.1.3 系统适用性与专属性试验

精密吸取“2.1.2”项下3种溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样，结果见图1。供试品色谱中，在与各对照品色谱峰相应保留时间处有吸收峰，各待测成分与相邻色谱峰分离度均大于1.5，而阴性对照未见相应待测成分色谱峰。

图1 十七味大活血胶囊中3种成分HPLC图

2.1.4 线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液1、2、4、8、10、15 µL，依次注入液相色谱仪，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定。以对照品浓度为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算3种成分的回归方程和线性范围，结果芍药苷、丹酚酸B、丹皮酚在各自的范围内线性关系良好，见表1。

表1 3种成分线性关系考察结果

2.1.5 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，结果芍药苷、丹酚酸B、丹皮酚峰面积RSD分别为0.8%、0.2%、0.3%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，记录色谱图，结果芍药苷、丹酚酸B、丹皮酚峰面积RSD分别为0.9%、0.9%、0.3%，表明供试品溶液中的3种成分在24 h内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验

分别平行取十七味大活血胶囊内容物（批号20201101）约1 g，共6份，精密称定，按“2.1.2.2”项下方法制得6份供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，用外标法计算各成分的含量，结果芍药苷、丹酚酸B、丹皮酚的平均含量分别为4.23、4.25、2.57 mg/g，RSD分别为0.6%、1.6%、1.3%，表明本方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验

取已知含量的十七味大活血胶囊（批号20201101）6份，每份约0.5 g，精密称定，分别置于6个50 mL锥形瓶中，加入各对照品适量，精密加入70%甲醇50 mL，按“2.1.2.2”项下方法制备，按“2.1.1”项下色谱条件进样，结果芍药苷、丹酚酸B、丹皮酚的平均加样回收率分别为100.5%、99.6%、100.6%，RSD分别为1.8%、1.4%、1.9%。

2.1.9 样品含量测定

称取3批十七味大活血胶囊样品（批号20201101、20201102、20201201），按“2.1.2.2”项下方法制备，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，用外标法计算各成分含量，结果见表2。

表2 3批十七味大活血胶囊样品中3种成分含量测定结果（mg/g）

2.2 不同溶出介质中的溶出行为比较

2.2.1 溶出介质制备

①水：纯化水。②人工胃液：取稀盐酸16.4 mL，加水约800 mL、胃蛋白酶10 g，摇匀后加水稀释成1 000 mL，即得[6]130。③人工肠液：即磷酸盐缓冲液（含胰酶，pH 6.8），取磷酸二氢钾6.8 g，加水500 mL使溶解，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，另取胰酶10 g，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释至1 000 mL，即得[6]425。

2.2.2 供试品溶液制备

按2020年版《中华人民共和国药典》（四部）溶出度测定法小杯法[6]132，以超声脱气的250 mL超纯水为溶出介质，转速75 r/min，待温度稳定在（37.0±0.5）℃，取同批十七味大活血胶囊12粒，投入溶出仪中，分别于5、15、25、35、45 min取样2 mL，过0.45 μm滤膜，得到以超纯水为溶出介质的供试品溶液，同时向杯中补充相同温度和体积的超纯水。同法得到以人工胃液和人工肠液为溶出介质的供试品溶液。

2.2.3 溶出度测定及溶出曲线整合模型建立

取“2.2.2”项下供试品溶液，进样测定，采用外标法计算芍药苷、丹酚酸B、丹皮酚在不同溶出介质中不同时间点的溶出量。将已测得的该制剂中3种成分的平均含量按标示装量换算值作为最大溶出量（100%），通过计算得到各时间点的相对累积溶出度。以相对累积溶出度为纵坐标，溶出时间为横坐标，绘制相对累积溶出曲线。将权重系数（ωi）定义为制剂中某一成分含量（Ci，累积溶出度）占3种成分总含量（C）的比值，即ωi＝Ci/（C1＋C2＋C3），计算得到芍药苷、丹酚酸B、丹皮酚自定义权重系数分别为0.37、0.39、0.24。计算十七味大活血胶囊在纯化水、人工胃液、人工肠液中不同时间点的整合累积溶出度（Dt）。Dt＝ω1×C1＋ω2×C2＋ω3×C3。同一成分在不同溶出介质中的相对累积溶出曲线及整合模型见图2，同一溶出介质中3种成分及整合模型的相对累积溶出曲线见图3。

图2 十七味大活血胶囊中3种成分及整合模型累积溶出曲线

图3 十七味大活血胶囊在不同溶出介质中的累积溶出曲线

2.2.4 不同溶出介质中溶出曲线相似性评价

根据国家食品药品监督管理总局《普通口服固体制剂溶出曲线测定与比较指导原则》[7]，采用相似因子（f2）法比较溶出曲线的相似度。，式中，Rt和Tt分别为参比样品和受试样品在时间t的溶出量，n为时间点个数。若f2≥50则认为该2条溶出曲线相似，反之则认为不相似；f2越接近100则相似程度越高，越接近0则相似程度越低[8]。通过计算相同活性成分及多成分整合模型在纯化水、人工胃液、人工肠液中溶出曲线f2，衡量各活性成分及整合模型在不同溶出介质中溶出曲线的相似度，结果见表3。通过计算在同一溶出介质中不同活性成分的溶出曲线f2，衡量不同活性成分在同一溶出介质中溶出曲线的相似度，结果见表4。

表3 不同溶出介质中十七味大活血胶囊中3种成分溶出行为相似度（f2）

表4 十七味大活血胶囊中3种成分在不同介质中的溶出行为相似度（f2）

3 讨论

十七味大活血胶囊的君药丹参及臣药赤芍、牡丹皮均具有活血功效，与该制剂活血化瘀、消肿止痛的功效相吻合，因此，本试验选取丹参、赤芍、牡丹皮的主要活性成分丹酚酸B、芍药苷、丹皮酚作为含量测定指标。此外，为保证各待测成分在检测波长处均为最大吸收，采用波长切换法[9-11]，并参考药典将检测波长设定为230 nm测定芍药苷（0～22 min）、286 nm测定丹酚酸B（22～40 min）、274 nm测定丹皮酚（40～50 min），从而准确测定各成分含量。

西药胶囊剂溶出度测定常使用900 mL溶出介质。经测定，每粒十七味大活血胶囊（0.35 g/粒）含芍药苷、丹酚酸B、丹皮酚的总量分别为1.47、1.53、0.92 mg，若使用900 mL溶出介质，在成分全部溶出的情况下其浓度也仅为1.0～1.7 μg/mL，而溶出试验起始阶段溶出介质中药效成分浓度更低，检测结果难以准确体现其溶出趋势，故本试验选择该制剂的日最大服用量12粒（3次/d，3～4粒/次）作为样品用量，溶出介质用量选择250 mL，并采用2020年版《中华人民共和国药典》（四部）溶出度测定法第三法（小杯法）考察其溶出行为。

十七味大活血胶囊中同一成分及多成分整合模型在人工胃液与人工肠液中的溶出曲线f2均大于60，且与纯化水比较，在人工胃液、人工肠液中的溶出曲线f2均小于45，表明十七味大活血胶囊在人工胃液、人工肠液中的溶出行为相似。结合溶出曲线可以看出，十七味大活血胶囊在人工胃液、人工肠液中的溶出速度及程度均明显高于纯化水。在同一溶出介质中，芍药苷与丹皮酚的溶出曲线f2均大于85，且二者与丹酚酸B的溶出曲线f2为48～66，丹酚酸B显示出不同于芍药苷、丹皮酚的溶出行为，可能与丹酚酸B自身的化学稳定性有关。有研究显示，丹酚酸B的化学稳定性差、易降解[12]，且丹参饮片在煎煮溶出过程中，随煎煮时间延长，丹酚酸B的含量逐渐降低，同时丹参素、原儿茶醛等其他丹参酚酸类成分含量持续增加[13]。十七味大活血胶囊中丹酚酸B的溶出转化情况有待进一步研究。

本研究建立了HPLC同时定量测定十七味大活血胶囊中芍药苷、丹酚酸B、丹皮酚含量的方法，并比较了3种成分在不同溶出介质中的溶出行为。中药制剂存在成分复杂、作用靶点不明确、作用途径不确定等特点，该制剂中丹参成分迷迭香酸、丹参酮ⅡA，大黄成分大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素，延胡索成分延胡索乙素，桃仁成分苦杏仁苷，以及陈皮成分橙皮苷等未能检测到，可能由于这些成分在制剂中含量较低，或化学分析条件受限。今后可继续优化色谱条件，采用化学指纹图谱法结合物质转移规律研究，以期更好控制十七味大活血胶囊的质量。