活血荣络方对脑缺血再灌注损伤大鼠PINK1/Parkin信号通路的影响

颜思阳，杨仁义，刘利娟，郭纯，尹倩，张宇星，周德生

1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007

脑梗死又称缺血性脑卒中，是脑动脉狭窄或闭塞、脑供血不足导致的脑组织坏死，具有高致残率、致死率，是脑卒中死亡的首要原因[1]。近年来，我国缺血性脑卒中发病率、患病率持续升高[2]。恢复缺血脑组织血液供应是急性缺血性脑卒中治疗的主要措施，但快速再灌注可对脑功能造成损伤，即脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）[3]，CIRI病理生理过程较为复杂，近年来发现线粒体自噬在CIRI过程中发挥重要作用[4]。PTEN诱导激酶1（PINK1）和帕金蛋白（Parkin）在CIRI过程中可启动线粒体自噬，特异性清除受损线粒体，保护组织免受损伤[5]。故研究PINK1/Parkin在CIRI过程中的表达及调控，对缺血性脑卒中的治疗具有重要意义。

脑梗死属中医学“中风”范畴。课题组在脑藏象理论指导下提出缺血中风之荣气虚滞病机体系[6-7]，认为荣气为一切精微物质的总称[8]，并将线粒体的生理、病理与荣气理论相联系，荣气的物质属性相当于现代医学的线粒体，而线粒体功能可体现荣气的作用[9]。基于荣气虚滞理论创制的活血荣络方是湖南中医药大学第一附属医院院内制剂，临床应用10余年，疗效显著。前期研究发现，活血荣络方能减轻CIRI，减少线粒体活性氧（ROS）产生，降低线粒体钙超载等[10]，但其对CIRI过程中线粒体自噬的调节机制还有待明晰。因此，本研究通过建立CIRI大鼠模型，

以PINK1/Parkin通路为切入点，从线粒体自噬角度探讨活血荣络方干预CIRI的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠40只，12～15周龄，体质量250～280 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物生产许可证号SCXK（湘）2016-0002。饲养于湖南中医药大学第一附属医院实验动物中心，温度21～26 ℃，湿度40%～50%，通风良好，昼夜交替光照。分笼、标准饲料喂养，适应性饲养7 d后用于实验。本研究经湖南中医药大学第一附属医院伦理委员会审查批准（20201010-13）。

1.2 药物及制备

活血荣络方（鸡血藤30 g，石楠藤30 g，生地黄15 g，玄参10 g，黄精15 g，乳香10 g，没药10 g，川芎10 g），饮片购自湖南中医药大学第一附属医院中药房，经湖南中医药大学第一附属医院张裕民主任药师鉴定符合2015年版《中华人民共和国药典》（一部）规定。上述饮片加10倍量水浸泡12 h，加热回流2 h，过滤，残渣加8倍量水，加热回流1 h，过滤，合并2次滤液，旋转蒸发仪浓缩，得活血荣络方浸膏，无菌玻璃瓶分装，4 ℃冰箱保存备用，使用时蒸馏水稀释至浓度约1.17 g/mL。雷帕霉素（美国Selleck公司，货号S1039），按说明书配制为0.5 mg/mL的溶液，-80 ℃冰箱保存。

1.3 主要试剂与仪器

RIPA裂解液、JC-1线粒体膜电位（MMP）检测试剂盒，货号分别为P0013B、C2006，上海碧云天生物技术有限公司；苯甲基磺酰氟（PMSF）、线粒体提取试剂盒，货号分别为P0100、SM0020，北京索莱宝科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒，货号70-PQ0012，杭州联科生物技术股份有限公司；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒，货号CW0022S，北京康为世纪生物科技股份有限公司；PINK1、Parkin、LC3B、p62、TOMM20、山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG，货号分别为ab23707、ab77924、ab48394、ab91526、ab186735、ab6721、ab6789，英国Abcam公司；RT First Strand cDNA Synthesis Kit、RNA提取液、2×SYBR Green qPCR Master Mix（Low ROX），货号分别为G3330、G3013、G3321，武汉赛维尔生物科技有限公司。大鼠栓线（型号2636A4、2638A4，北京西浓科技有限公司），透射电子显微镜（型号Tecnai G2 Spirit BioTWIN，美国FEI公司），石蜡切片机（型号HM325，美国Thermo Scientific公司），显微成像系统（型号BA410E，中国Motic公司），低温高速离心机（型号Fresco17，美国Thermo Scientific公司），化学发光凝胶成像分析仪（型号ChemiDocTMXRS＋，美国Bio-Rad公司），小型垂直电泳槽（型号1658001，美国Bio-Rad公司），荧光定量PCR仪（型号C1000 TouchTMThermal Cycler，美国Bio-rad公司），超微量分光光度计（型号NanoDrop2000，美国Thermo Scientific公司），超净工作台（型号SW-CJ-1FD，苏州苏净安泰），多功能酶标仪（型号Enspire，美国Perkinelmer公司），超纯水仪（型号Milli-QIQ-7000，美国Millipore公司）。

1.4 造模、分组及给药

40只大鼠随机分为假手术组、模型组、活血荣络方（HXRLF）组和自噬激活剂（RAP）组，每组10只。模型组、HXRLF组、RAP组参考文献[11]，采用大脑中动脉阻塞/再灌注法制备CIRI大鼠模型：钝性分离大鼠右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），从距ECA与ICA分叉部约4 mm处45°剪口进栓线，插入栓线约18 mm梗阻右侧大脑中动脉，梗阻2 h后拔出栓线进行再灌注。假手术组仅分离CCA、ECA、ICA，不插入栓线。采用Zea-Longa 5级评分法[11]对大鼠神经功能进行评分，评分1～3分大鼠纳入后续实验。HXRLF组分别于造模前36、12 h及造模后12 h灌胃活血荣络方药液11.7 g/kg，假手术组、模型组、RAP组予等体积蒸馏水灌胃；RAP组于再灌注同时予雷帕霉素溶液1.5 mg/kg腹腔注射[12-14]，假手术组、模型组、HXRLF组予等体积生理盐水腹腔注射。

1.5 神经功能评分

再灌注24 h后，采用Zea-Longa 5级评分法[11]对大鼠神经功能进行评分，分值越高表明神经功能缺损越严重。0分：活动正常，提尾时两前爪伸向地面，无神经缺损症状；1分：提尾时对侧前肢不能完全伸直，爬行时向对侧转圈；2分：提尾时对侧前肢屈曲内收，爬行时向对侧转圈；3分：站立不稳，爬行时向偏瘫侧跌倒；4分：有意识障碍，不能自发行走。

1.6 尼氏染色

再灌注24 h后麻醉大鼠，腹主动脉采血，经心脏灌注生理盐水200 mL，以4%多聚甲醛溶液继续充分灌注，断头，取缺血损伤侧脑组织，于4%多聚甲醛中固定保存。脑组织经脱水、透明、浸泡、石蜡包埋、冠状位切片、脱蜡、复水、尼氏染色等步骤后，光学显微镜下观察每组切片5个不同视野，显微成像系统获取皮质区神经元尼氏染色图像，采用Image J软件处理，观察大鼠皮质区完整神经元数量[15]。

1.7 超微结构观察

大鼠断头取脑，冷冻台上分离大鼠脑组织，取皮质区约1 cm3组织于4%戊二醛中固定，电镜室包埋、检测。

1.8 线粒体膜电位检测

取100 mg皮质区脑组织，生理盐水清洗，于2 mL EP管中剪碎，加入1 mL预冷的裂解缓冲液，冰上研磨20次；4 ℃梯度离心获得线粒体沉淀，加入0.5 mL洗涤缓冲液重悬，再次梯度离心后获得高纯度线粒体沉淀；0.1 mL贮存缓冲液重悬；配制JC-1染色工作液和缓冲液，0.9 mL JC-1染色工作液中加入0.1 mL纯化的线粒体，多功能酶标仪激发波长514 nm、发射波长529 nm检测绿色荧光强度，激发波长585 nm、发射波长590 nm检测红色荧光强度，以红绿荧光比值计算MMP。当MMP较高时，JC-1聚集在线粒体基质中，形成聚合物，呈红色荧光；当MMP较低时，JC-1不能聚集在线粒体基质中，此时JC-1为单体，产生绿色荧光。

1.9 免疫组化检测

脑组织石蜡包埋，切片（5 μm），常规脱蜡、脱水、抗原修复、漂洗、封闭；分别滴加LC3B（1∶200）、p62（1∶200）、TOMM20（1∶100）一抗，4 ℃孵育过夜；PBS漂洗，滴加二抗，37 ℃孵育1 h，PBS漂洗，DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树脂封片，于显微镜（×400）下观察。阳性染色为棕黄或棕褐色。随机选取5个视野，用Image J软件分别计算LC3B、p62、TOMM20阳性表达的平均光密度。

1.10 Western blot检测

取皮质区脑组织置于冰上，加入裂解液（裂解液∶PMSF＝100∶1）裂解，匀浆机充分研磨，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度；各组取30 μg蛋白上样，经SDS-PAGE、转膜、5%脱脂牛奶室温封闭，加入LC3B（1∶1 000）、p62（1∶2 000）、TOMM20（1∶2 000）、PINK1（1∶1 000）、Parkin（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育过夜；洗膜3次，10 min/次，加山羊抗兔（1∶8 000）、山羊抗小鼠（1∶8 000）二抗，37 ℃孵育1 h，洗膜后凝胶成像分析仪成像。使用Image J软件统计蛋白灰度值，以目的蛋白与β-actin灰度值比值表示蛋白相对表达量。

1.11 RT-PCR检测

取100 mg皮质区脑组织，加入1 mL Trizol，匀浆机充分研磨，提取总RNA，检测RNA浓度及纯度，反转录为cDNA。按PCR试剂盒说明书进行扩增，反应体系：2×qPCR Mix 7.5 μL，2.5 μmol/L基因引物1.5 μL，反转录产物2.0 μL，ddH2O 4.0 μL；反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，熔解曲线60～95 ℃，每15 s升温0.3 ℃（循环40次）。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.12 统计学方法

采用SPSS25.0统计软件进行分析。实验数据以±s表示，神经功能评分采用Mann-WhitneyU检验，其余指标比较采用方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 活血荣络方对模型大鼠神经功能的影响

假手术组无神经功能缺损，与假手术组比较，模型组大鼠神经功能评分明显升高，神经功能缺损严重，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，HXRLF组、RAP组大鼠神经功能评分明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠神经功能评分比较（±s，分）

表2 各组大鼠神经功能评分比较（±s，分）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

组别 只数 神经功能评分假手术组 10 0模型组 10 2.80±0.63**HXRLF组 10 2.40±0.52##RAP组 10 2.20±0.63##

2.2 活血荣络方对模型大鼠皮质区神经元数量的影响

完整神经元经尼氏染色后在光镜下呈蓝紫色，可见尼氏小体包围，见图1。假手术组神经元结构形态正常。与假手术组比较，模型组大鼠尼氏小体数目明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01），表明完整神经元数量减少；与模型组比较，HXRLF组、RAP组大鼠尼氏小体数目增加，差异有统计学意义（P＜0.01），表明完整神经元数量增加。见图2。

图1 各组大鼠神经元结构（尼氏染色，×400）

图2 各组大鼠皮质区尼氏小体数目比较（±s，每组5只）

2.3 活血荣络方对模型大鼠皮质区超微结构的影响

透射电镜结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠皮质区双层膜结构的自噬小体数目增多；与模型组比较，HXRLF组和RAP组大鼠皮质区双层膜结构的自噬小体数目明显增多。见图3。

图3 各组大鼠皮质区超微结构（bars＝2 μm）

2.4 活血荣络方对模型大鼠皮质区线粒体膜电位的影响

与假手术组比较，模型组大鼠皮质区MMP明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，HXRLF组和RAP组大鼠皮质区MMP明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图4。

图4 各组大鼠皮质区MMP比较（±s，每组5只）

2.5 活血荣络方对模型大鼠皮质区LC3B、p62、TOMM20蛋白表达的影响

免疫组化及Western blot结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠皮质区LC3B、p62蛋白表达升高，TOMM20蛋白表达降低，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，HXRLF组、RAP组大鼠皮质区LC3B蛋白表达升高，p62、TOMM20蛋白表达降低，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。见图5～图8。

图5 各组大鼠皮质区LC3B蛋白阳性表达（免疫组化染色，×400，±s，每组5只）

图8 各组大鼠皮质区p62、LC3B、TOMM20蛋白表达比较（±s，每组5只）

2.6 活血荣络方对模型大鼠皮质区PTEN诱导激酶1、帕金蛋白蛋白和mRNA表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠皮质区PINK1、Parkin蛋白和mRNA表达升高（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，HXRLF组和RAP组大鼠皮质区PINK1、Parkin蛋白和mRNA表达升高（P＜0.05，P＜0.01）。见图9、图10。

图6 各组大鼠皮质区p62蛋白阳性表达（免疫组化染色，×400，±s，每组5只）

图9 各组大鼠皮质区PINK1、Parkin mRNA表达比较（±s，每组5只）

图10 各组大鼠皮质区PINK1、Parkin蛋白表达比较（±s，每组5只）

图7 各组大鼠皮质区TOMM20蛋白阳性表达（免疫组化染色，×400，±s，每组5只）

3 讨论

脑梗死后局部脑缺血和再灌注引发的级联反应可激活线粒体自噬。脑缺血发生后，脑血流急剧减少导致氧、糖缺乏，引起线粒体结构异常，氧化磷酸化发生障碍；再灌注期间，由氧供恢复引起的氧化应激反应是再灌注损伤的核心环节，而线粒体是其中的关键场所。CIRI过程中低氧、钙超载等多种因素作用引起线粒体氧化磷酸化障碍、ROS生成增多、清除能力下降，导致ROS大量积累引发过度氧化应激，进一步加重线粒体损伤，而损伤的线粒体是加重CIRI的关键因素。因此，应及时清除受损或功能失调的线粒体。但目前对于线粒体自噬在CIRI过程中的作用仍存在争议。Wang等[16]研究表明，在CIRI大鼠模型中，激活线粒体自噬改善了氧化应激诱导的线粒体功能损伤，减轻了神经功能损伤。而Shi等[17]研究表明，抑制线粒体自噬，可抑制自噬性细胞死亡。因此，进一步探究CIRI与线粒体自噬的关系，可为缺血性脑卒中的治疗提供重要依据。

活血荣络方基于荣气虚滞理论创立而成，以鸡血藤、石楠藤为君，生地黄、玄参、黄精为臣，佐以乳香、没药、川芎为使。全方虽有滋补肝肾之品，但不会滋腻妨碍气血运行；虽有辛温微燥之品，亦不致伤阴加重阴虚，而能鼓动气血，促进活血化瘀之功；其有阴有阳，阴阳相互制约，又互根互用，以达阴阳平衡之态，切合线粒体自噬异常之病机[9]。LC3作为自噬标志蛋白，主要包括胞质中的LC3Ⅰ和自噬小体膜上的LC3Ⅱ，二者可相互转化，LC3Ⅱ被认为是自噬形成的标志分子。p62可充当支架蛋白与LC3结合，进而被溶酶体降解，其表达通常与自噬水平呈负相关，即自噬水平升高时，p62表达降低，反之表达升高；当自噬小体与溶酶体形成受阻时，自噬小体降解受阻，LC3Ⅱ和p62会累积，可能出现p62与LC3Ⅱ表达同时升高[18-19]。线粒体膜蛋白TOMM20可反映线粒体含量变化，且在线粒体自噬激活时表达下调[20]。本研究结果表明，HXRLF组和RAP组大鼠神经功能评分显著降低，神经元结构有所改善，自噬小体数量增加，MMP升高，p62、TOMM20蛋白表达降低，LC3B蛋白表达升高，提示活血荣络方可能通过激活线粒体自噬以保护受损脑组织。

Wu等[21]研究表明，激活PINK1/Parkin通路可激活线粒体自噬，抑制细胞凋亡，保护神经细胞。PINK1是一种线粒体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可在线粒体外膜上募集OPTN、CALCOCO2/NDP52等自噬受体，而OPTN可与SQSTM1/p62形成复合物，共同调节选择性自噬。Parkin是一种E3泛素连接酶，位于细胞质中，在线粒体降解中起重要作用，通常Parkin募集至受损线粒体需PINK1介导，其在线粒体外膜上积累以对线粒体损害作出响应，最终通过p62蛋白与LC3蛋白结合，使线粒体降解。本研究结果表明，活血荣络方和雷帕霉素均可上调PINK1、Parkin蛋白及mRNA水平，激活线粒体自噬。

综上，活血荣络方可能通过激活PINK1/Parkin信号通路，激活线粒体自噬，减轻CIRI，本研究可为阐明活血荣络方干预CIRI的机制提供实验依据。