睾酮冰冻人血清国家标准品的研制

于 婷， 沈 敏， 曲守方， 孙 楠， 孙 晶， 黄 杰

（1. 中国食品药品检定研究院体外诊断试剂所非传染病诊断试剂室，北京 100050；2. 美康生物参考实验室，浙江 宁波 315104）

睾酮是一种重要的雄激素，主要来源于睾丸间质细胞。在雄性睾丸、雌性卵巢以及肾上腺中均有分泌。睾酮在机体内具有维持生殖功能和第二性征、增强肌肉强度与质量、维持骨密度[1]等重要的生理作用。有研究结果表明，生理水平的睾酮对男性心血管系统有益，睾酮缺乏与心血管疾病的发生有关[2-3]。睾酮水平增高常见于尿毒症、男性性早熟、先天性肾上腺皮质增生症、前列腺肿瘤[4-5]等。睾酮水平降低常见于先天性睾丸发育不全或不发育、隐睾、性腺功能减退[6]等疾病。因此，准确测定血清中的睾酮水平，对于疾病的诊断、监测具有重要意义。目前，血清基质的睾酮国际标准品购买周期较长，且费用较高，而我国仅国家卫生健康委临床检验中心制备过冰冻人血清睾酮标准品，但数量较少，远不能满足实际需求。因此，我们研制了人血清基质的睾酮国家标准品，以促进血清中睾酮测定的标准化。

1 材料和方法

1.1 主要仪器和试剂

S40 SevenMulti综合测试仪、XS205DU电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；N-EVAP 24位氮吹仪（美国Organomation公司）；2XZ-1旋片式真空泵（临海谭氏真空设备公司）；LC30AD-QTRAP5500超高效液相色谱-质谱联用仪、AB5500液相色谱-质谱联用仪（美国ABSCIEX公司）；TQ-S高效液相色谱-质谱联用仪（美国Waters公司）；MS-C120全自动化学发光仪（宁波美康公司）；cobas 8000全自动免疫分析仪（瑞士罗氏公司）；IS1200全自动化学发光测定仪（四川迈克公司）。均匀性和稳定性评价用试剂盒：睾酮检测试剂盒（化学发光免疫分析法，批号20180725，宁波美康公司）。互通性评价用试剂盒：血清睾酮检测试剂盒[电化学发光法，批号353201，罗氏诊断产品（上海）有限公司]、睾酮测定试剂盒（化学发光法，批号0919031，四川迈克公司）。

1.2 方法

1.2.1 侯选品制备 收集外观透明、清澈，无脂血、溶血和黄疸的血清，同时检测乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗体、人类免疫缺陷病毒抗体和梅毒螺旋体抗体，取4种病毒抗体检测均为阴性的血清样本，按照睾酮浓度的高低合并成2个不同水平的大样，分别混匀后，进行多重过滤和除菌处理。将过滤后的血清按照0.5 mL分装入1.5 mL棕色冷冻玻璃瓶。制备好的候选品于-70 ℃条件下保存。

1.2.2 均匀性分析 按照文献[7-8]要求进行均匀性分析。在分装的前、中、后各抽取10支候选品，采用MS-C120全自动化学发光仪进行测定，每支候选品均测定3次。

1.2.3 短期稳定性分析 按照文献[9]要求进行短期稳定性分析。分别于第1、2、3、5、7、12、20、30 d 8个时间点从候选品Ⅰ、Ⅱ中各随机抽取6支，分别在-20 ℃、（2～8）℃、（20～25）℃条件下各放置2支，各时间点的取样时间保持一致，采用MS-C120全自动化学发光仪进行测定，每支候选品测定3次，求均值，中间穿插测定2个水平质控品。以各时间点为横坐标，以候选品测定均值为纵坐标作图，采用Excel 2010软件进行线性拟合回归分析，评价候选品稳定性的趋势性变化，并计算斜率（k）、截距（b）和斜率（k）的标准差（sk），计算公式为：

在置信水平p=0.95、自由度为n-2的条件下，查t-分布界值表，得到对应的t（0.95，n-2）值。计算t（0.95，n-2）·sk的值，比较|k|值与t（0.95，n-2）·sk的值，如果|k|

1.2.4 联合定值 要求参加定值的实验室近2年睾酮项目参考实验室外部质量评价计划（the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine External Quality Assessment Scheme for Reference Laboratories in Laboratory Medicine，RELA）比对，或国内参考实验室室间比对结果达到国际或国内参考实验室及格标准，且数量不少于3家。定值方法均采用参考测量程序[10]。要求实验前必须采用中国计量科学研究院纯品标准物质或其他有证参考物质校准参考测量程序，同时测定质控物质。实验分3批（次）进行。每批（次）分别依次测定有证标准物质-质控物质-2个水平候选品，每批（次）每个样本平行处理3份，每份重复检测3次，每个样本最后得到9个数据，3批（次）每个样本共收集27个数据。按照以下标准判定数据是否有效：（1）样本测定结果应在±2s范围内，和s分别是指全部实验室所有结果的和s，且室内变异系数（coef ficient of variation，CV）≤5.0%；（2）质控物质测定结果应在靶值±5.0%范围内，且室内CV≤5.0%。不满足要求的数据为无效数据，直接剔除，取各实验室2个水平候选品的有效数据的均值，合并计算总均值，作为该样本的最终靶值。

1.2.5 不确定度分析 以Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement（GUM）为基础，依据GB/T 15000.3—2008《标准样品工作原则（3）标准样品定值的一般原则和统计方法》进行。不确定度来源包括均匀性、稳定性和定值。候选品的合成标准不确定度（uCRM）的计算公式为：

式中uchar为定值引入的标准不确定度，ubb为均匀性引入的标准不确定度，us为稳定性引入的标准不确定度。

1.2.6 互通性评估 依据文献[11]，采用参考方法和常规方法同时对选定的一系列具有代表性的临床血清样本（通常不少于20份）和候选品进行检测，采用通过2种方法测定临床样本的结果建立数学回归关系。以参考方法测定值为X，以常规方法测定值为Y，用Origin 8.0软件绘制散点图。如果候选品常规方法的测定均值在该区间内，说明该候选品在该常规方法上无基质效应，其在参考方法和常规方法间具有互通性。

2 结果

2.1 均匀性分析结果

单因素方差分析结果显示，睾酮候选品Ⅰ、Ⅱ的F值分别为1.448 5和1.569 6，均

表1 睾酮侯选品均匀性分析结果

2.2 稳定性分析结果

对睾酮候选品Ⅰ、Ⅱ进行3种温度下30 d短期稳定性评价，候选品Ⅰ、Ⅱ在20～25℃放置30 d均不稳定，但在2～8 ℃及-20 ℃均可稳定30 d。减少时间点继续分析候选品在20～25 ℃的稳定期限，结果显示：20～25 ℃条件下，候选品Ⅰ可稳定5 d，候选品Ⅱ可稳定20 d。见表2、表3。

表2 睾酮候选品3种温度短期稳定性分析结果

表3 睾酮候选品20～25 ℃短期稳定性分析结果

2.3 联合定值结果

有3家实验室参加了联合定值。睾酮候选品Ⅰ、Ⅱ定值结果的实验室内CV分别不高于3.2%、2.3%，表明各实验室建立的参考方法稳定，数据可靠。见表4。

表4 睾酮候选品联合定值结果

2.4 不确定度分析结果

2.4.1 定值引入的不确定度 定值引入的不确定度计算公式为：

式中s为全部实验室测值的总s，p为实验室总数。候选品I、Ⅱ定值引入的不确定度分别为0.007 5、0.032 2 ng/mL。

2.4.2 均匀性引入的不确定度 均匀性引入的不确定度计算公式为：

式中n为有效单元数。候选品I、Ⅱ均匀性引入的不确定度分别为0.019 1、0.035 6 ng/mL。

2.4.3 稳定性引入的不确定度 稳定性引入的不确定度计算公式为：

式中sk为稳定性数据经线性拟合得到方程的斜率（k）的s，x为候选品的有效期。睾酮候选品稳定性引入的不确定度结果见表5。

表5 睾酮候选品稳定性引入的不确定度

2.4.4 合成不确定度 候选品Ⅰ、Ⅱ的合成不确定度分别为0.025 1、0.078 1 ng/mL。经联合定值及不确定度分析，睾酮候选品Ⅰ、Ⅱ的定值结果分别为（0.22±0.05）ng/mL（k=2）、（3.67±0.16）ng/mL（k=2）。

2.4.5 互通性评估 采用参考方法和2个不同常规方法同时测定不少于25份新鲜血清样本，通过新鲜临床样本测定结果得到线性回归方程，将参考方法测定均值为X轴，计算睾酮候选品的95%可信区间，结果显示，该候选品常规方法测定值均位于该区间范围内，侯选品具有良好的互通性。见表6。

表6 睾酮候选品的互通性评价结果

3 讨论

样本中睾酮的检测方法包括气相色谱、液相色谱、气相色谱-质谱、高效液相色谱、高效液相色谱-质谱、同位素稀释法。这些方法的检出灵敏度很高，线性范围较宽，但对操作人员、仪器等要求非常高；且耗时长，成本较高，因此并未在临床上得到广泛应用。

目前，临床上最常用的是基于抗原抗体反应的化学发光法和酶联免疫法，检测速度快，且易于操作，已有几十个品牌的商品化试剂盒。然而，各品牌试剂盒因溯源方法、校准品基质、抗原抗体等原料的选择等不尽相同，测定值之间存在较大差异。同时，随着睾酮临床检测的广泛开展，以及我国对于试剂盒产品的溯源性要求越来越严格，市场对于睾酮标准物质的需求量较大，因此本研究制备了一批血清基质睾酮候选品。该候选品以人源血清为基质，不添加防腐剂和抗菌药物，最大限度地保持了临床样本的特性。日常保存在-70 ℃条件下，运输均采用干冰，从而可保证候选品的稳定性。该候选品均匀性和稳定性评价结果均为满意，稳定性在一定使用条件下满足要求，且互通性良好。根据ISO导则35[12]和国家标准物质技术规范，3个实验室均采用参考方法对侯选品进行联合定值。测量前对仪器进行校准、验证和维护，并且对建立的参考方法进行了确认，以确保维持检测能力，从而保证结果测定的可靠性。

总之，本研究制备的睾酮冰冻人血清侯选品，稳定性、均匀性、互通性良好，定值结果准确，可以作为国家标准品使用。该血清睾酮标准品将主要用于试剂盒研发过程的量值溯源、试剂盒产品注册以及临床常规检测系统的正确度评价等，将促进临床血清睾酮检测结果的互认以及睾酮检测试剂盒的监管。