单宁酸抑制肺炎克雷伯菌生物膜形成的作用及其机制

周燕霞， 金东芳

（金华市人民医院检验科，浙江 金华 321000）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是引起院内感染的主要革兰阴性菌，可诱发一系列疾病，包括血流感染、呼吸道感染以及肝脓肿，重症监护病房中免疫功能受损的患者更易感染[1]。目前，碳青霉烯类抗菌药物（亚胺培南和美罗培南）是治疗肺炎克雷伯菌感染的主要药物，但随着此类药物的广泛使用，碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae，CRKP）开始出现，甚至使临床面临无药可用的局面[2]。肺炎克雷伯菌可以形成生物膜，使抗菌药物难以渗透入细菌内发挥杀菌作用。因此，迫切需要寻找新的化合物或植物提取物，以解决这一难题[3]。单宁酸是从植物组织中（如茶叶）提取的具有抗菌和抗病毒活性的化合物。有研究结果表明，单宁酸对大肠埃希菌生物膜形成有一定的抑制作用，但对CRKP的作用仍未知[4]。本研究旨在通过分析单宁酸抑制肺炎克雷伯菌生物膜形成的机制，为临床控制CRKP感染提供参考。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

收集3株分离自2019年金华市人民医院住院患者痰液样本的CRKP（KP1、KP2、KP3）和1株碳青霉烯敏感肺炎克雷伯菌（KP 13883），质控菌株大肠埃希菌（ATCC 25922）、肺炎克雷伯菌（ATCC 13883）购自国家卫生健康委临床检验中心。

1.2 仪器和试剂

荧光定量PCR仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；单宁酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；1%结晶紫粉末（美国Thermo Fisher Scientific公司）；S-3000N电子显微镜（日本HITACHI公司）。实时荧光定量PCR试剂盒（日本TOYOBO公司）；M-H肉汤（英国OXOID公司）；亚胺培南干粉、美罗培南干粉（上海广锐生物科技有限公司）。

1.3 体外药物敏感性试验

采用微量肉汤稀释法检测3株CRKP和1株KP13883对2种常用碳青霉烯类药物（亚胺培南和美罗培南）的敏感性。结果判读根据美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2019标准[5]。

1.4 菌株生长能力测定

参照文献[6]进行细菌生长能力测定。将3株CRKP和1株KP 13883接种到M-H琼脂平板上，37 ℃条件下静置过夜培养；用接种环挑取单个菌落于10 mL M-H培养基中，37 ℃、200 r/min条件下过夜培养。第2天按1∶100比例进行稀释，以同样条件进行亚培养，以加入8 mg/mL单宁酸的培养管为对照，每2 h测定1次600 nm处的吸光度（A600nm）值。

1.5 生物膜形成能力检测

采用结晶紫染色法[7]测定生物膜形成能力。细菌在平板3区划线生长后，挑取单个菌落于10 mL M-H肉汤中，37 ℃ 180 r/min过夜培养；吸取100 μL菌液至10 mL M-H肉汤中，再吸取10 μL加入含190 μL M-H肉汤的96孔板中，同时做3个复孔，以不加菌液的200 μL M-H肉汤作空白对照，同时以加入8 mg/mL单宁酸的培养管为对照。培养24 h后弃去浮游细菌，用磷酸盐缓冲液洗2次，干燥后加入200 μL结晶紫染色10 min，弃去染液，加入250 μL无水乙醇，静置10 min，吸取100 μL，用于测定A600nm，计算3个复孔的平均值。

1.6 扫描电子显微镜观察

参照文献[8]培养生物膜，选取生物膜形成能力相对较强的KP2进行此试验。挑取单个菌落于10 mL M-H肉汤中，37 ℃过夜培养。弃去上清，重悬菌液并调至0.5麦氏浊度，按1∶100比例稀释菌液，将不锈钢片放入6孔板中，每孔加入2 mL稀释后的菌液，37 ℃静置培养24 h，使细菌在不锈钢片上形成生物膜。以加入8 mg/mL单宁酸的培养管为对照。待生物膜形成后，弃去培养液，用磷酸盐缓冲液冲洗3次，风干。向6孔板中加入2 mL 2.5%戊二醛固定生物膜。再分别用50%、70%、80%、90%、100%无水乙醇脱水10 min，干燥后镀金，采用S-3000N电子显微镜扫描观察。

1.7 生物膜相关基因表达量分析

选取生物膜形成能力相对较强的KP2进行生物膜形成相关基因的表达量分析。分别在含和不含单宁酸的条件下，采用实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测生物膜相关基因（mrkA、luxS和wbbM）的表达量。引物参照文献[9]进行合成。采用2－ΔΔCt方法计算生物膜形成相关基因的表达量，以肺炎克雷伯菌（ATCC 13883）为对照菌株，以rpoB为内参基因。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.8 统计学方法

采用GraphPad Prism 7.0软件对数据进行统计分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外药物敏感性试验结果

3株CRKP均对亚胺培南和美罗培南耐药（MIC均≥64 μg/mL），1株KP 13883对2种药物均敏感，MIC分别为0.25和0.5 μg/mL。

2.2 单宁酸对菌株生长速度的影响

3株CRKP在不含单宁酸的条件下均生长良好，12 h左右达到稳定期。在培养基中加入8 mg/mL单宁酸后，CRKP的生长均受到抑制，A600nm下降强度为2.0～3.0。单宁酸对敏感菌株KP13883也存在抑制作用。见图1。

图1 单宁酸对4株肺炎克雷伯菌生长能力的影响

2.3 生物膜形成能力分析

在不含单宁酸的条件下，肺炎克雷伯菌生物膜形成能力较强。但在培养基中加入8 mg/mL单宁酸时，形成的生物膜相对较少，A600nm下降强度约为1.5（P<0.05）。见图2。

图2 单宁酸对4株肺炎克雷伯菌生物膜形成能力的影响

2.4 扫描电子显微镜形态观察结果

扫描电子显微镜观察结果显示，在不含单宁酸的条件下，细菌生长良好，细菌之间相互聚集成群，遍布整个视野[图3（a）]。当在培养基中加入8 mg/mL单宁酸时，细菌形成的生物膜量明显减少，细菌散落地分布于视野中[图3（b）]。

图3 单宁酸对肺炎克雷伯菌生物膜形成能力的影响电镜观察结果（×2 000）

2.5 生物膜相关基因表达量分析

加入与未加入单宁酸相比，群体感应相关基因luxS和脂多糖相关基因wbbM的表达量明显下降（P<0.05）。与肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛编码相关的操纵子基因mrkA略有上调，但差异无统计学意义（P>0.05）。见图4。

图4 单宁酸对肺炎克雷伯菌生物膜形成相关基因表达量的影响

3 讨论

肺炎克雷伯菌是一种条件致病性革兰阴性有荚膜细菌，具有高耐药性[10]。近年来，携带碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌逐渐增多，导致此类细菌感染患者的发病率和病死率明显增加[11]。

SHAO等[4]发现，单宁酸对大肠埃希菌的生长及其生物膜的形成有一定的抑制作用，可作为一种新的抗菌化合物。本研究收集了3株CRKP，以1株碳青霉烯敏感菌株KP 13883作为对照，结果显示，单宁酸对CRKP和碳青霉烯敏感株菌KP 13883的生长均有一定的抑制作用；进一步通过96孔板结晶紫染色法进行分析，发现单宁酸可以明显抑制肺炎克雷伯菌生物膜生成，扫描电子显微镜观察结果进一步证实了这一点。因此，单宁酸降低生物膜形成的机制可能是抑制细菌本身的生长。

为了进一步从分子角度分析单宁酸抑制肺炎克雷伯菌生物膜形成的机制，本研究对肺炎克雷伯菌生物膜形成相关基因的表达量进行了分析。结果显示，单宁酸并未降低与肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛相关的基因mrkA的表达量[9]。然而，单宁酸可以明显降低与群体感应功能相关的基因luxS和脂多糖相关基因wbbM的表达量[9]。这提示单宁酸可以降低细菌交流所需要的信号，使群体感应功能受到影响，减少细菌间交流，进而使生物膜形成的量减少。此外，单宁酸还可以通过降低脂多糖含量，使细菌的黏附能力降低，进而削弱其生物膜形成能力[9，12]。

综上所述，单宁酸对肺炎克雷伯菌生物膜的形成能力有一定的抑制作用，其机制主要是通过降低群体感应功能相关基因luxS和脂多糖相关基因wbbM的表达量。本研究结论对控制和治疗由CRKP引起的感染有一定的参考价值。