水稻三系不育系的分子设计改良与应用

柳武革，王 丰，李金华，朱满山，廖亦龙，付崇允，刘迪林，曾学勤，马晓智，霍 兴，孔 乐

（广东省农业科学院水稻研究所/广东省水稻育种新技术重点实验室/广东省水稻工程实验室，广东 广州 510640）

“民以食为天，食以稻为先”。水稻是我国重要的粮食作物之一，其种植面积占粮食作物播种面积的25%左右，稻谷产量占粮食总产的35%以上，全国近六成以上的人口以稻米为主食，也是广东省最重要的粮食作物［1］。2021 年中央一号文件明确提出要提升粮食和重要农产品供给保障能力，打好种业翻身仗。

广东地处我国南端，属亚热带季风气候，气温高，降水多，台风出现频繁。高温多湿的气候导致水稻生产上的病虫害发生偏重。稻瘟病是影响广东省水稻产量和品质的主要病害之一，尤其以山区和早稻发生严重，造成产量损失通常为10%～20%［2］。此外，白叶枯病也是广东省水稻生产仅次于稻瘟病的主要病害之一［3］。每年9—10 月台风肆虐，叶片损伤，白叶枯病菌趁机侵染，造成病害流行。近年来，广东晚稻白叶枯病发生偏严重。实践表明，利用品种本身的抗病性防治病害是最经济、最简便而又立竿见影的技术措施［4］。

随着水稻基因组重测序、功能基因组和基因组大数据库的深入研究，大量的抗病虫、耐逆、品质等优异基因被定位或克隆［5］，通过分子育种策略导入有利基因创制优异材料已经付诸实践之中。陈志伟等［6］通过分子设计育种培育出携有Pi-2、Pi-1、Pi-Kh、Xa21、Xa23基因的两系不育系禾9S；金素娟等［7］通过分子标记辅助选择技术将Pi-1基因导入两系不育系GD-8S 中；柳武革等［8］通过分子标记辅助选择技术将Pi-1、Pi-2基因导入温敏核不育系GD-7S 中培育出RGD-7S；张亚东等［9］等通过分子标记技术聚合低直链淀粉含量基因Wx-mp、香味基因fgr、稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi-b等4 个基因，选育出优质、高产、多抗、早熟的水稻新品系南粳58。

近年来广东省农业科学院水稻研究所在水稻三系不育系选育方面取得了卓越的成效［10］，优质三系不育系荣丰A 就是代表性成果之一［11］。利用荣丰A 与不同恢复系组配出26 个不同类型的杂交稻组合通过国家和省级审定，在全国累计推广种植493 万多hm2。然而，随着时间的推移，部分杂交稻组合已经在某些稻区出现稻瘟病抗性下降的现象。因此，有必要通过分子育种技术精准导入抗病基因，加快选育新的具有持久抗病特性和优质食味的不育系。

我们从2004 年开始，着手对优良三系不育系荣丰A 的保持系荣丰B 进行分子设计改良，经过17 年的努力，先后育成4 个不育系通过技术鉴定，配组了18 个杂交稻组合通过广东省品种审定。

1 三系不育系的分子改良策略和育种实践

为进一步提升荣丰A 的抗性和稻米品质，我们提出通过分子设计育种策略，将来源于BL122的2 个抗稻瘟病基因（Pi-1、Pi-2）、来源于CBB23 的抗白叶枯病基因（Xa-23）和来自粤丰B的降低直链淀粉含量基因（Wxb），分别导入至其保持系荣丰B 中。采用的方法是先将1～2 个优良基因定向回交导入，然后再杂交聚合，最后再回交转育成不育系的技术路线（图1）。通过多次回交和自交，并结合分子标记辅助选择，将稻瘟病抗病基因Pi-1导入后育成吉丰B，然后与荣丰A 杂交及连续回交，最终转育成不育系吉丰A；将Pi-1和Pi-2导入荣丰B，育成携带Pi-1和Pi-2的安丰B，然后与荣丰A 杂交及回交，最终转育成不育系安丰A。同时也将白叶枯病抗性基因Xa23和低直链淀粉基因Wxb分别导入荣丰B 中，育成携带Pi-1、Pi-2和Xa23的保持系荣3B，然后与荣丰A 杂交及连续回交，最终转育成不育系荣3A；将携带Pi-1的吉丰B 和荣丰B-Wxb杂交聚合Pi-1和Wxb育成粤禾B，然后转育成不育系粤禾A。现将4 个不育系的选育过程详述如下：

图1 三系不育系的分子设计改良育种程序Fig.1 Improved breeding procedure of molecular design for CMS lines

1.1 吉丰A 和安丰A 的分子育种过程

2004 年晚季利用荣丰B 与携带广谱抗瘟基因的材料BL122 杂交，2005 年早季种植F1代，并以其作父本再与荣丰B 回交；2005 年晚季种植BC1F1，利用与Pi-1紧密连锁的SSR 标记RM144［12］、与Pi-2紧密连锁的SSR 标记AP22［13］对回交群体单株进行PCR 检测，选择携带有两个基因的单株，以其作父本继续与荣丰B回交，2006 年早季种植BC2F1代和利用分子标记检测分析，同样选择携带有两个目的基因的单株继续与荣丰B 回交，2006 年晚季种植BC3F1代，结合分子标记检测选择携带有两个目的基因的单株继续与荣丰B 回交，2007 年1 月在海南三亚种植BC4F1代回交群体，经分子标记检测分析，选择携带有两个目的基因农艺性状优良的单株，成熟后收获种子。2007 年4 月在广州种植所选的4个携带有两个目的基因的单株BC4F2代群体，插秧后分别对各单株取样抽提DNA 并进行标记检测分析，筛选出Pi-1、Pi-2两个基因纯合的、株叶形态较好、柱头白色的优良单株6 个，Pi-1纯合且株叶形态和生育期等性状与原始荣丰B 最为接近的单株16 个。

2007 年晚季所有这些单株与荣丰A 杂交，2008 年1 月在海南三亚加代种植所有杂交F1及其相应父本（保持系），并镜检F1的花粉育性，选择花药呈水泽状、败育彻底的单株作进一步的成对回交；之后不断进行杂交和回交，2011 年晚季在广州种植BC8F1世代，不育系和保持系表现整齐度好，异交习性好、繁种产量较高。最终将含有Pi-1基因的不育系定名为吉丰A，含有Pi-1、Pi-2两个基因的不育系定名为安丰A。2011 年6月吉丰A 和安丰A 通过广东省种子管理总站组织的不育系技术鉴定。

1.2 粤禾A 的分子育种过程

2008 年早季利用吉丰B 与直链淀粉含量较低、米饭饭味佳的保持系中间材料（荣丰B//天丰/粤丰B）杂交，当年晚季种植F1代。2009 年早季单株种植F2代960 株，插秧15 d 后，对所有单株进行Pi-1和Wxb分子标记检测，选择两个基因纯合、农艺性状较好的单株23 个；同年晚季继续种植F3代株系。2010 年早季种植F4代株系，抽穗后选择抽穗较整齐一致群体中的优良单株与安丰A成对测交16对，2010年晚季种植测交F1代，抽穗后对每个单株镜检，选择花药呈水泽状、花粉败育彻底的单株与其对应的F5代株系父本继续成对回交，之后不断进行回交转育工作。于2016年育成农艺性状稳定的不育系和保持系，定名为粤禾A 和粤禾B，2018 年10 月通过广东省农作物品种审定委员会办公室组织的不育系鉴定。

1.3 荣3 A 的分子育种过程

2007 年晚季，以荣丰B6/CBB23 的BC6F2世代抗白叶枯病的优良单株为母本，与荣丰B4/BL122 的BC4F2世代Pi-1、Pi-2的两个基因纯合的优良单株为父本，通过杂交聚合白叶枯病基因Xa23、稻瘟病基因Pi1、Pi2等3 个基因，2008年早季种植F1世代，晚季种植F2群体，继续分子标记辅助选择筛选三基因纯合优良单株，2009年早季继续种植F3代，并进一步进行白叶枯病接种鉴定和分子标记检测，确保3 个基因的纯合。

从2009 年晚季开始选择多个优良株系与穗丰A 杂交，2010 年早季种植所有杂交F1及其相应父本（保持系），并镜检F1的花粉育性，选择花药呈水泽状、败育彻底的单株作进一步的成对回交；之后不断进行花粉镜检和回交转育工作。

2015 年早季不育系和保持系农艺性状稳定，初步暂定名为荣3A 和荣3B。2018 年10 月通过广东省农作物品种审定委员会办公室组织的不育系鉴定。

2 改良不育系的特性

2.1 农艺性状表现

荣丰A 及系列衍生不育系的农艺性状和抗病性表现如表1 所示。这5 个不育系的株高变幅为64.8～68.6 cm，每株穗数变幅7.8～9.3 条，千粒重变幅23.8～24.8 g。田间种植表现株型集散适中，分蘖力较强，剑叶挺直。吉丰A 和粤禾A 叶缘紫色，柱头和稃尖紫色，安丰A 和荣3A 叶缘浅绿色，柱头和稃尖无色。花药呈水渍状，花粉败育以典败为主，开花习性好，异交结实率达60%以上，繁、制种产量高，一般单产可达200 kg/667m2以上。在生育期方面，吉丰A、安丰A 和粤禾A 等3 个不育系的播始历期与荣丰A 相当，荣3A 的播始历期比荣丰A 长5～7 d。

表1 荣丰A 衍生系列不育系的农艺性状和抗病性表现Table 1 Agronomic traits and disease resistance of Rongfeng A and improved CMS lines derived from it

2.2 抗病性和品质表现

吉丰A、安丰A、粤禾A 和荣3A 的稻瘟病人工接种鉴定总抗性频率为93.3%～100%，比荣丰A 的82.3%明显提高。结合田间抗性，4 个改良不育系的稻瘟病综合评价为高抗，而荣丰A 仅为中抗。此外，荣3A 由于导入了白叶枯病抗性基因，对白叶枯病也表现高抗。

经农业部稻米及制品质量监督检验测试中心（杭州）检测，主要品质性状结果见表2。粤禾A 导入了低直链淀粉含量基因Wxb，测定的直链淀粉含量为13.8%，显著低于其他4 个不育系的24.7%～26.9%。同时粤禾A 的胶稠度显著提高，米饭的口感大幅度改善。

表2 荣丰A 及衍生系列不育系的稻米品质性状表现Table 2 Rice quality traits of Rongfeng A and improved CMS lines derived from it

3 配组应用

3.1 区试产量表现

截至2021 年，仅本团队利用吉丰A、安丰A、粤禾A 和荣3A 这4 个不育系先后选育了18 个品种通过广东省品种审定（表3）。18 个品种在广东省区试中的产量变幅为406.86～541.10 kg/667m2，比对照增产幅度为-3.55%～14.30%。其中，两年区试平均比对照增产3%以上的品种有13 个，占比72.22%；平均比对照增产8%以上的品种有8个，占比44.44%，表现丰产稳产性较好。这些组合大多数已经在华南稻区大面积推广应用。

表3 改良不育系所配组合在广东省区试中的产量和稻瘟病抗性表现Table 3 Yield and blast resistance of the hybrids derived from improved CMS lines in the regional trials of Guangdong Province

3.2 抗病性表现

18 个组合先后在不同年份参加了广东省杂交稻区试的初试和复试，每个组合均进行了两次抗病性鉴定。结果（表3）表明，18 个组合36 次人工接种鉴定总抗性频率的变幅为75.0%～100%，叶瘟发病1.0～3.1 级，穗瘟发病1.0～5.0 级。综合评价表现为中抗有8 次，占比22.2%，表现抗级的10 次，占比27.8%，表现高抗的18 次，占比50%。说明这些不育系导入稻瘟病抗性基因后，由其组配的杂交稻组合均表现出较好的稻瘟病抗性。此外，荣3 优1002 由于母本含有白叶枯病基因Xa23，表现高抗稻瘟病，抗白叶枯病。

3.3 农艺性状表现

改良不育系组配的18 个组合在广东省区试中农艺性状表现列于表4。所有组合的株高变幅为94.1～107.2 cm，有效穗数变幅16.1 万～19.4 万条/667m2，穗长变幅20.1～22.6 cm，每穗总粒数变幅129.5～156.5 粒，每穗实粒数变幅109.0～130.0粒，结实率变幅78.6%～85.6%，千粒质量变幅24.3～30.7 g。这些组合在大田生产种植，表现株叶形态集散适中，剑叶挺直，茎秆较粗壮，韧性好，后期熟色好，抗倒性强。

表4 改良不育系所配组合在广东省区试中的农艺性状表现Table 4 Agronomic traits of the hybrids derived from improved CMS lines in the regional trials of Guangdong Province

4 讨论

一直以来，稻瘟病在我国水稻种植区均有不同程度发生，给水稻生产造成巨大的产量损失。很多省份在水稻品种的审定环节中，对稻瘟病综合评价表现感或高感的品种实行一票否决不予审定。最近，国家农作物品种审定委员会已经修订国家水稻品种审定标准，进一步提高了不同稻作区的稻瘟病抗性审定标准。很多高产优质的品种经常因为稻瘟病抗性不过关，导致无法通过审定。因此，育种家必须对稻瘟病抗性给予足够的重视。

随着生物技术手段的发展，科学家已经定位至少100 多个稻瘟病抗性基因，其中有36 个已经克隆［14］，为稻瘟病抗性的分子设计育种奠定了坚实的基础。由于不同稻作区的稻瘟病生理小种差异很大，复杂多变，不同抗性基因在不同稻作区抗性表现也有差异。多个研究表明，Pi-1和Pi-2基因对来自不同稻作区的生理小种具有比较好的抗性。Chen 等［15］利用我国南方稻区715 个稻瘟病菌株对携带不同抗性基因的鉴别品种进行接种鉴定，结果发现携带Pi-1品种的抗性频率为92.45%，携带Pi-2品种的抗性频率为89.65%，同时携带两个抗性基因的品种抗性频率为98.04%。朱小源等［16］采用146 个来自广东不同稻区的稻瘟病生理小种对多个单基因系接种，结果Pi-1的抗性频率为80.1%，Pi-2的抗性频率为48.6%。同时发现这两个抗性基因具有很好的互补性［16-17］，推荐在华南稻区优先考虑使用。

我们从2001 开始，通过分子标记辅助选择将Pi-1基因定向导入两系不育系GD-8S 中，不同改良株系的抗性频率为75.76%～100%［7］。之后，又通过杂交、回交结合分子标记辅助选择，将Pi-1和Pi-2两个基因聚合导入温敏核不育系GD-7S 中，5 个改良株系的抗性频率为94.12%～97.06%［8］。其中一个株系命名为RGD7S，于2012 年10 月通过广东省种子管理总站组织的不育系技术鉴定。利用RGD7S 先后组配了聚两优750 和聚两优747 通过省级品种审定，均表现抗稻瘟病。多年的育种实践表明，Pi-1和Pi-2基因在南方稻区具有较为持久的抗性。本研究通过三系保持系的系统改良，育成了4 个不育系，其中吉丰A 和粤禾A 只含有Pi-1，安丰A 和荣3A 含有Pi-1和Pi-2基因。利用这4 个不育系选育的18 个省级审定杂交稻组合稻瘟病综合评价均在中抗以上，进一步证实Pi-1和Pi-2基因在杂交稻中的利用价值。

近年来，国内对三系保持系和不育系的改良也有一些报道。刘士平等［12］利用分子标记辅助选择将Pi-1导入保持系珍汕97B 中，获得了17个抗性显著改良的含有目标基因的株系。涂世航等［18］将Pi25导入保持系福稻B 中选育出抗稻瘟病不育系CP4A；张礼霞等［19］通过分子标记辅助选择导入Pigm基因改良粳稻保持系；董瑞霞等［20］通过分子标记辅助选择将谷梅2 号的Pi25导入保持系臻达B，回交转育获得稻瘟病抗性强的不育系157A。吴婷婷等［21］将广谱持久抗稻瘟病基因Pi9的导入三系保持系丰源B，育成高抗稻瘟病的丰源A-Pi9-5。伍豪等［22］将抗白叶枯病基因Xa7导入优质保持系美B 中。

本研究改良的保持系为本团队自主培育的三系不育系荣丰A 的保持系荣丰B。荣丰A 异交结实率高、配合力强，由其组配的杂交稻组合抗倒性好、耐高低温、不易落粒、后期转色好。为了进一步延长该不育系的使用寿命，我们将抗稻瘟病基因、抗白叶枯病基因、低直链淀粉含量基因等一个或多个优良基因导入，育成了4 个不育系通过技术鉴定。通过全基因组芯片扫描分析，这4 个不育系与荣丰A 的相似度均在90%以上，农艺性状也比较接近。由它们组配的杂交稻组合也保留了荣丰A 杂交稻组合的优点，得到了市场的广泛认可。到目前为止，吉丰优华占累计推广面积超过3.33 万hm2，吉丰优1002 被认定为超级稻，2019 年开始成为国家和广东省区试晚籼感光组的对照品种，累计推广面积超过13.33 万hm2。

随着更多调控水稻产量、品质、抗逆、营养高效等重要农艺性状的关键基因的解析［11,22］，育种家们将会进一步建立高效精准的水稻设计育种体系，紧密结合水稻常规育种和杂种优势利用技术，培育出一系列高产优质多抗新品种，为解决我国粮食安全问题提供有效策略。