香稻不同发育时期香味物质的变化分析

潘阳阳，周德贵，黄道强，王重荣，李 宏，王志东，陈宜波，赵 雷，龚 蓉，周少川

（广东省农业科学院水稻研究所/广东省水稻育种新技术重点实验室/广东省水稻工程实验室，广东 广州 510640）

【研究意义】广东是我国重要的水稻主产省份之一，国家统计局数据显示，近5 年广东稻谷年播种面积在180 万hm2左右，产量达1 050 万t。当前，水稻产业处于提质增效转型关键期，发展优质稻是提高种植效益、优化品种结构的重要举措［1］。广东优质稻育种在全国处于领先地位［2］，于2018 年提出振兴广东丝苗米战略，以丝苗米产业园为抓手，打造丝苗米品牌。首届全国优质稻品种食味品质鉴评中，广东丝苗米品种美香占2 号、象牙香占和增科新选丝苗1 号获得首届全国十大优质稻品种食味品质鉴评（籼稻）金奖，此后美香占2 号又连续获得第二届和第三届全国优质稻品种食味品质鉴评金奖，已成为丝苗米产业园主栽品种。截至2021 年1 月，广东已创建18 个省级丝苗米产业园，有力带动了优质米产业高质量发展。香味是丝苗米必须具备的食味品质性状，是稻米价格的重要决定因素［3］。因此，解析丝苗米品种香味物质组分，特别是从动态角度考量水稻发育过程中香味物质的变化，对于打造不同类型香米品牌、培育广东丝苗米新品种具有重要指导意义。【前人研究进展】香味是稻米的重要品质性状，泰国香米、五常大米等品牌稻米均具有浓郁的香味，除日本以外多数亚洲国家消费者对香味具有偏好性。稻米中已发现上百种挥发性化合物［4-7］，通常根据香米散发出来的香气差异，将香型分为爆米花型、茉莉花型、紫罗兰型、山核桃型等［8］。1983 年，Buttery 等［9］确认2-乙酰-1-吡咯啉（2AP）是香稻特征香气成分，2AP 是一种极易挥发的亲脂性小分子化合物，其阈值仅为0.1 μg/kg，呈典型“爆米花”香味而极易被感知，几乎在所有香稻中均能被检出［10］。研究表明，香稻是由于香味基因BADH2功能性缺失，导致2AP 被特异积累［11-12］。香稻地上组织中2AP 含量通常高于精米［13］，籽粒中90%以上2AP 分布于精米，米糠中2AP 含量不足10%［14］。不同的badh2突变类型导致2AP 积累程度表现出较大差异［15］，即使是相同的badh2突变类型，其2AP 含量也存在明显差异［16-17］，一方面由于品种间存在适应性的差异，另一方面与2AP 代谢通路中其他基因活性密切相关［18］；此外，产地、气候、栽培方法、储藏条件等环境因素均能够影响香味强度［19-23］，即使同一品种在不同地域种植，其香味往往表现不同。除2AP外，其他类型香味化合物也是导致香稻间食味品质差异的重要因素。Widjaja 等［24］对3 种香米米饭的挥发性物质比较发现，Jasmine 和Goolarah 的吲哚含量更高，而Basmati 的2-苯基乙醇含量最高、正己醛含量最低。Yang 等［25］对6 种不同风味米饭的挥发性成分进行分析，其中2-AP、己醛、2-壬烯醛，辛醛、庚醛和壬醛的气味活性值占比均达97%以上，而1-辛烯-3-醇、2-辛烯醛、2,4-壬二烯醛、2,4-癸二烯醛、癸醛、2-庚酮和愈创木酚对不同类型稻米风味的形成起重要贡献；Hinge 等［26］比较Basmati-370 和Ambemohar-157在籽粒成熟过程中的香味物质差异，发现Basmati-370 中2AP 含量低于Ambemohar-157，但2-壬醛、壬醛、庚醛、辛醇、1-辛烯-3-醇和2-戊基呋喃的含量均显著高于后者，这可能是两者风味差异的主要原因。【本研究切入点】关于广东优质丝苗米香味成分的比较研究较少，特别是对不同组织器官、尤其是对生殖生长阶段的枝梗、颖壳等组织中的香味物质鲜有研究。【拟解决的关键问题】本研究对美香占2 号和象牙香占两个广东丝苗米代表品种生长发育过程中的香味物质进行分析，揭示香味物质变化特性，比较两个品种香味物质差异，重点揭示2AP 在籽粒发育过程中的含量变化特征。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1供试品种与种植条件 选用广东省农业科学院水稻研究所保存的美香占2 号和象牙香占水稻品种种子，于2019 晚季在广东省农业科学院水稻研究所大丰育种基地种植，单株移栽，株行距为16.7 cm×16.7 cm，两行后隔一行种植，采用常规水肥方式管理。

1.1.2样品采集 分别收集拔节期顶二叶（S1）、孕穗期穗（S2 为颖花、S3 为枝梗）、开花后10 d谷粒（S4 为乳熟期籽粒，S5 为颖壳）、20 d 谷粒（S6为蜡熟期籽粒，S7 为颖壳）、30 d 谷粒（S8 为成熟期籽粒，S9 为颖壳）。每个样品由12 个以上单株样品混合制备，所有样品均在上午9：00—10：00 收集，液氮冷冻后保存在-80 ℃冰箱；收集两个品种自然晒干的谷粒，后续处理获得S10糙米和S11 精米。

1.2 试验方法

1.2.1样品制备 对冷冻鲜样进行真空冷冻干燥处理：采用德国Christ 冻干机（型号Alpha 1-4 LSC basic），在-40 ℃真空冷冻条件下对S1～S9等样品干燥48 h。叶片、枝梗和谷壳等样品采用IKA 研磨器研磨4～5 min 至无法继续粉碎为止。

稻谷利用砻谷机（中储粮有限公司，型号JIG-Ⅲ）进行 脱壳，获得相应糙米，再经碾米机（中储粮有限公司，型号JNM-III）对糙米进行去皮，获得精米。利用芬兰Perten3310 型实验室粉碎磨机对籽粒样品、糙米和精米进行研磨，粉末样品过425 μm 孔径筛网，用于后续试验。

1.2.2挥发性成分萃取 采用瑞士CTC Analytics AG 公司多功能自动进样系统RTC120，准确称取2 g 粉状样品，放入20 mL 顶空瓶中，加入1 μL 2,4,6-三甲基吡啶（TMP，溶于乙醚，浓度0.05 mg/mL）作为内标，迅速拧紧顶空瓶瓶盖，放入90 ℃水浴锅中，平衡5 min 后，迅速插入固相微萃取装置（SPME Arrow DVB/CWR/PDMS 萃取头），90 ℃条件下吸附40 min。

1.2.3挥发性成分检测 把萃取头插入色谱仪的进样口进行解吸附，进样口温度为250 ℃，解吸附时间为2 min。利用安捷伦8890 气相色谱串联5977B 质谱仪对样品的挥发性成分进行数据采集和分析。

气相条件：气相色谱柱DB-5MS（60 m×0.32 mm×0.25 μm，美国安捷伦公司）；载气为氦气，流速为1.0 mL/min；不分流进样，程序化升温为35 ℃保持3 min，随后以5 ℃/min 的速率上升至85 ℃，保持5 min 后以相同速率上升至120 ℃，保持6 min 后以相同速率上升至210 ℃，传输线温度250 ℃。

质谱条件：电子轰击型离子源；电离电压70 eV；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；接口温度280 ℃；扫描模式为全扫，m/z 为35～450。

1.2.4数据处理 对GC-MS 检测所得的原始数据利用Masshunter 工作站进行处理，并与NIST17库中数据比对，以质谱数据（匹配度得分大于70.0）和线性保留指数（偏差在10 个单位内），确定挥发性物质成分。以TMP 为内标，计算各化合物的相对含量：

2 结果与分析

2.1 水稻样品中香味物质成分分析

美香占2 号和象牙香占各11 份不同时期的样品挥发物成分及含量见表1。所有水稻样品共检出63 种香味物质，分为杂环类、烃类、醛类、醇类、酮类、酯类和其他等7 类，每类分别含有5、11、16、9、12、8、2 种香味物质。大多数样品香味物质数量在35～40 种之间，每个样品平均含36 种化合物，其中十二烷、十三烷、十四烷、己醛、庚醛、苯甲醛、辛醛、壬醛、癸醛、十一醛、苯甲醇、正壬醇、香叶基丙酮和辛酸乙酯等14 种物质在所有样品中均被检出。此外，2AP、十一烷、5-甲基十三烷、3-甲基十三烷、2,6,10-三甲基十二烷、1,2,3,4-四氢-1,6-二甲基-4-（1-甲基乙基）萘、2-壬烯醛和正己醇等8 种物质在所有籽粒样品中均被检出。

相同时期两个品种间香味物质种类相近，均在孕穗期最多，其中美香占2 号孕穗期颖花和枝梗分别含有40、43 种香味物质，象牙香占孕穗期颖花中含有42 种香味物质；颖壳中香味物质种类较少，其中10 d 颖壳中香味物质种类最少，分别为28、27 种。所有香味物质中，仅三甲基环己烯酮在美香占2 号中被特异检出，2-辛烯-1-醇只在象牙香占中被检出。以上结果表明美香占2 号和象牙香占香味物质构成相似，且在籽粒成熟过程中，香味物质种类变化特征基本一致。

2.2 不同水稻样品间香味物质含量比较

对63 种香味物质含量进行分析发现，美香占2 号孕穗期枝梗中有19 个化合物含量达到最高，此外孕穗期颖花、10 d 颖壳和叶片分别含有13、11、8 个峰值化合物，孕穗期颖花和枝梗中峰值香味物质数量占比达一半以上，包括大多数醛类、醇类和酮类，表明美香占2 号在孕穗期香味物质种类最多，且多数物质在此时含量最高。象牙香占在孕穗期颖花和10 d 颖壳中各含有16 个峰值化合物，包括大多数醛类、烃类、酮类和醇类，而叶片和孕穗期枝梗中分别有10、3 个含量最高化合物，表明象牙香占在孕穗期和开花初期香味物质含量最为丰富。值得注意的是，个别香味物质在30 d 颖壳中含量最高，如具有柑橘香味的正壬醇，以及象牙香占中具有菠萝香味的辛酸乙酯和2-辛烯酸乙酯，说明水稻发育过程中不同香味物质的合成代谢和积累特性存在明显差异。

2.3 两个香稻品种发育过程中2AP 含量比较

从图1 可以看出，美香占2 号和象牙香占2AP 均在叶片中含量最高，分别达104.93、119.25 ng/g，籽粒中2AP 含量明显低于叶片，随着籽粒成熟2AP 含量呈下降趋势，糙米中2AP 含量分别为3.86、8.06 ng/g，所有颖壳样品中未检出2AP。美香占2 号孕穗期颖花和枝梗中2AP 总量高于叶片，但各时期籽粒中2AP 含量均低于象牙香占。从籽粒2AP 空间分布来看，美香占2 号精米与糙米2AP 含量比为97.9%，象牙香占精米2AP 占64.4%，说明美香占2 号籽粒2AP 主要积累在胚乳中。

图1 两个香稻品种不同发育时期2AP 含量的动态变化Fig.1 Dynamic change of 2AP content in two aromatic rice cultivars at various developmental stages

2.4 糙米和精米中香味物质的比较

两个香稻品种糙米和精米中香味物质含量丰富，包含所有烃类、大多数醛类和醇类、少数酮类和酯类共约40 种香味化合物。从表2 可以看出，烃类含量最高，其次为醛类和醇类，糙米中各类香味物质含量整体高于精米，个别物质如1-辛烯-3-醇、4-氧代异佛尔酮在精米中未检出，表明糙米中香味物质组分和含量多于精米。此外，2-甲基苯并呋喃、正庚醇和γ-壬内酯只在糙米或精米中被检出，说明在大米加工过程中能够产生个别新的香味物质。

表2 两个香稻品种糙米和精米中挥发性成分含量Table 2 Contents of volatile components in brown rice and polished rice of two aromatic rice cultivars（ng/g）

进一步比较两个香稻品种精米中香味物质差异发现，美香占2 号精米除2AP 含量低于象牙香占外，其他烃类、醛类、醇类、酮类和酯类中的多数组分含量均略高于象牙香占。另外，1,2,4-三甲基苯、异佛尔酮只在美香占2 号精米中被检出，而苯乙醛、1-辛烯-3-醇和γ-壬内酯在象牙香占精米中被特异检出，这些香味物质构成及含量的差异，可能对两种米饭饭香的塑造起重要作用。

3 讨论

顶空固相微萃取法是目前香味物质检测的主要方法［17,27-29］，本试验采用瑞士CTC 公司RTC120 自动化取样设备，结合目前最高性能的安捷伦8890 气相色谱串联5977B 系统，在前期对香稻糙米2AP 含量测定所需的萃取温度、萃取时间和上样量等条件进行优化基础上，一次性对所有样品进行测定，数据偏差小，可信度较高。

从香味物质的分布来看，叶片中不含特定的香味成分，只有8～10 种香味物质在叶片中含量达到峰值，而孕穗期香味物质积累最为丰富，表明香味物质在生殖生长时期能够被持续合成，由于香味物质具有极易挥发的特性［30］，这可能是水稻开花期“稻香”最浓郁的原因所在。同时，通过改善孕穗期水肥管理，有助于2AP 积累［31-32］。另外，发现11～16 个香味物质在10 d 或30 d 颖壳中含量最高，其生物学意义尚不清楚。

在食味品质鉴评中，象牙香占较美香占2 号具有更浓的香味［33］；同时，Luo 等［34］、Okpala 等［35］均发现象牙香占籽粒中2AP 含量高于美香占2 号，本研究与其结果一致。同时，本研究进一步发现，美香占2 号在各时期籽粒中2AP 含量均低于象牙香占，这可能与2AP 代谢通路的调控密切相关，具体原因有待进一步研究。

美香占2 号和象牙香占是当前广东丝苗米的代表品种，成熟籽粒中检出40 多种香味物质，与Basmati-370 籽粒中54 种香味物质［26］、泰国香米91 种香气成分和五常大米68 种香气成分［36］相比，所有香稻中2AP 均是香稻香味构成的主要成分，同时，烃类、醛类和醇类化合物含量最为丰富，但不同类型香米中香味化合物种类有较大差异，如Basmati-370 中含有香草醛、芳樟醇、2-乙基-1-己醇、水杨酸甲酯等香味物质，泰国香米中的正己醇、1-辛烯-3-醇、苯酚、4-甲基苯酚、正己醇和1-辛烯-3-醇等，五常大米中香草醛、2,4-葵二烯醛、3-甲基苯酚、4-甲基苯酚和苯丙酮等化合物，而丝苗米中含有反式肉桂醛、苯甲醇、正壬醇、辛酸乙酯等物质，这些化合物可能对各自香米特征性风味的形成发挥作用。

由于米糠中营养素和生理活性物质含量远高于胚乳［37-38］，糙米的营养价值要高于精米，本研究也发现糙米中香味物质含量明显多于精米。因此，在丝苗米品牌创建过程中要注重加工环节，应当防止丝苗米过度精加工，同时有必要建立相关的糙米食味评价指标及体系，对于强化稻米营养价值、提高米饭饭香具有重要意义。

4 结论

本试验分析了美香占2 号和象牙香占两个优质香稻不同发育时期11 份样品的香味物质成分，共检测到63 种香味物质，每个样品平均含36 种化合物，美香占2 号在孕穗期枝梗中含有43 种化合物，其中19 个物质在此时期含量最高，象牙香占孕穗期颖花中含有的化合物种类最多为42 种，其中16 个为峰值化合物，这些物质包括多数醛类、醇类和酮类化合物；两个品种在10 d 颖壳中香味物质种类最少，分别有28 种和27 种化合物，表明两个香稻品种在生长发育过程中香味物质变化特性整体相似，孕穗期是香味物质积累的关键时期。叶片中2AP 含量最高，随着籽粒成熟，各样品中2AP 含量呈下降趋势，而象牙香占各时期籽粒2AP 含量均高于美香占2 号，但精米中烃类、醛类、醇类、酮类和酯类等多数香味化合物含量低于美香占2 号，这可能是两者饭香差异的主要原因。本研究揭示了香稻中香味物质的动态变化特性，将为研究香稻品种特性、推进优质香米品牌建设等提供理论依据。