不同日龄鸡喉黏膜淋巴组织中的T 和B 淋巴细胞分布检测

杨树宝，张英楠

（1.吉林医药学院，吉林吉林 132013；2.吉林农业大学动物科技学院，吉林长春 130118）

呼吸道直接与外界相通，是机体最先接触细菌、病毒等病原微生物的部位之一。呼吸道黏膜下的固有层内存在一些淋巴组织，构成了机体抵御外界病原微生物入侵的第一道免疫屏障，可提供对多种细菌和病毒等黏膜致病原侵袭的保护，这些淋巴组织被称为呼吸道相关性淋巴组织（RALT），包括鼻黏膜相关淋巴组织（NALT）、支气管相关淋巴组织（BALT）以及分布于喉和气管黏膜中的淋巴组织[1-3]。存在于这些淋巴组织中的T、B 淋巴细胞是RALT 最重要的免疫细胞，对于局部及整个机体的免疫保护发挥重要作用。本课题组前期已经对不同日龄家禽的鼻、气管以及肺脏中的CD3+T淋巴细胞和Bu-1+B 淋巴细胞的定位分布变化进行了报道[4-6]，并证明鼻、气管和肺脏中淋巴细胞的类型、定位分布以及数量都呈日龄相关性变化，而这些变化又可以反映呼吸道黏膜及机体的免疫状态。

喉作为呼吸道的重要组成部分，突出于呼吸系统和消化系统所组成的十字交叉处，此定位的特殊性和重要性使其成为黏膜免疫的关键部位。喉腔内壁层是假复层柱状纤毛上皮，固有膜浅层有黏液性腺泡，其周围分布有淋巴组织。一方面流经鼻咽部的混于空气中的悬浮颗粒和病原菌一定会经过喉口进入气管或肺脏，另一方面，由支气管和气管所分泌的黏液也会经过喉口进入口咽部[7]。因此，喉作为下呼吸道的门户，在呼吸道局部免疫中起到重要作用。目前关于喉部淋巴组织的研究较少，仅有学者对人和牛的喉部淋巴组织进行过研究[8-11]，但是对家禽至今还未见相关报道。

本研究利用免疫组织化学方法结合计算机图象分析技术观察不同生长发育阶段T、B 淋巴细胞在喉黏膜中的出现、迁移、组织定位和分布等发育过程，从而反映不同发育时期鸡喉黏膜的免疫状态变化，以期为进一步研究家禽喉黏膜的免疫机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

200 枚海兰白鸡种蛋，购自长春净月潭旅游开发区银河养殖场。对种蛋进行常规孵化，雏鸡进行常规饲养。

1.2 主要试剂及用具

冰冻切片用OCT 组织包埋液，为美国Sakura公司产品；小鼠抗鸡CD3 和Bu-1 单克隆抗体，为美国Southern Biotechnology 公司产品；Ultra Sensitive SP 超敏试剂盒kit 9901，为福州迈新公司产品；依爱EIF/C.DME3456 孵化机/出雏机，为广东依爱孵化机厂产品；Leica CM1850 冰冻切片机，为德国Leica 公司产品；Olympus CX41 显微镜，为日本Olympus 公司产品；Pixera pro150ES 图像采集器，为美国Pixera 公司产品。

1.3 试验设计

对200 只试验用海兰白鸡种蛋进行孵化，鸡出壳后置于动物室中常规饲养。分别选择未经过疫苗免疫的18、20 日龄鸡胚，以及1、4、7、14、21、35 和56 日龄的雏鸡，每个时期取3 只鸡胚或雏鸡的喉。将喉组织制成冰冻切片，片厚5 μm，-80 ℃保存备用。

1.4 免疫组织化学染色程序

每张切片滴加3% H2O2，室温下孵育10 min，然后PBS 洗3 次，每次3 min；除去PBS，每张切片分别滴加小鼠抗鸡CD3 和Bu-1 单克隆抗体工作液，37 ℃孵育1 h，PBS 洗3 次，每次3 min；每张切片滴加聚合物增强剂（试剂A），室温下孵育20 min，PBS 洗3 次，每次3 min；每张切片加酶标抗鼠/ 兔聚合物（试剂B），室温下孵育30 min，PBS 洗3 次，每次3 min；以DAB 显色后，使用苏木精复染，自来水冲洗返蓝；使用梯度酒精脱水，二甲苯透明处理，最后以中性树脂封片并照相。

1.5 图像分析及统计学处理

应用Image-pro plus 6.0 图像分析软件，测定喉黏膜中单位视野内阳性细胞面积。同日龄选取3个样本，每个样本制作3 张连续切片，每张切片在10 倍物镜下随机选取3 个视野，取平均值。应用SPSS 18.0 软件，对不同日龄的同一阳性细胞进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 胚胎期及出壳后1～7 日龄T、B 淋巴细胞分布规律

胚胎20 日龄和出壳后1 日龄时，喉黏膜中没有CD3+T 淋巴细胞和Bu-1+B 淋巴细胞出现。4 日龄时，CD3+T 淋巴细胞和Bu-1+B 淋巴细胞都首次出现在喉黏膜中，而且都主要分布在喉腔底壁的正中黏膜嵴中（图1-A、1-B），此时CD3+细胞的数量显著高于Bu-1+细胞（P＜0.05，图2）。

与4 日龄比较，7 日龄时喉黏膜中CD3+T 淋巴细胞和Bu-1+B 淋巴细胞的数量都显著增加（P＜0.05，图2），而且在喉黏膜中形成淋巴聚集物，其表面被覆假复层柱状纤毛上皮。淋巴聚集物中CD3+T 淋巴细胞和Bu-1+B 淋巴细胞数量相当，但分布情况差异较大，CD3+T 淋巴细胞占据淋巴聚集物的中下部区域（图1-C），而Bu-1+B 淋巴细胞主要位于淋巴聚集物外周，从整体分布上来看，二者恰好互补，分界较为明显，除淋巴聚集物外其他部位很少有Bu-1+B 淋巴细胞存在（图1-D）。

2.1 14～56 日龄T、B 淋巴细胞分布规律

与7 日龄比较，14 日龄时CD3+T 淋巴细胞和Bu-1+B 淋巴细胞数量变化不大（图2），但是分布有较大变化：此时，喉黏膜中大的淋巴聚集物不多，而是淋巴细胞散布在几乎所有部位的喉黏膜固有层中，局部形成小的淋巴聚集物（图1-E）；Bu-1+B 淋巴细胞此时较CD3+T 淋巴细胞多，虽仍主要分布于CD3+T 淋巴细胞的外周，但分界不如7 日龄时明显，有部分Bu-1+B 淋巴细胞穿插分布于CD3+T 淋巴细胞之间（图1-F）。

21 日龄时，喉黏膜固有层中淋巴细胞更为集中，尤其是Bu-1+B 淋巴细胞此时较之前日龄更为集中（图1-G），数量显著高于14 日龄，并显著高于CD3+T 淋巴细胞（P＜0.05，图2）。

35 日龄时，喉黏膜中CD3+T 淋巴细胞和Bu-1+B 淋巴细胞的数量比21 日龄时均显著增加（P＜0.05），而且此时Bu-1+B 淋巴细胞数量显著高于CD3+T 淋巴细胞（P＜0.05，图2）。

56 日龄时，黏膜固有层底端出现主要由Bu-1+B 淋巴细胞构成的生发中心（图1-H），而CD3+T 淋巴细胞则分布在生发中心周围的滤泡间区域（图1-I）。此时整个喉黏膜中Bu-1+B 淋巴细胞和CD3+T 淋巴细胞的数量均较35 日龄有所增加，但是差异并不显著（P＞0.05），但Bu-1+B 淋巴细胞的数量仍显著高于CD3+T 淋巴细胞（P＜0.05，图2）。

图1 喉黏膜中淋巴组织及其T、B 淋巴细胞分布情况

图2 喉黏膜中T、B 淋巴细胞的数量变化

3 讨论

研究喉黏膜淋巴组织中免疫细胞的分布对了解喉的免疫功能至关重要。因此，本研究采用免疫组织化学方法对不同日龄鸡喉黏膜中CD3+T 淋巴细胞和Bu-1+B 淋巴细胞的定位分布变化进行观察，从而了解鸡喉的免疫状态。研究发现，4 日龄时，CD3+T 淋巴细胞和Bu-1+B 淋巴细胞都首次出现，而且都主要分布在喉腔底壁的正中黏膜嵴中。这些淋巴细胞之所以能都集中出现在喉腔底壁的正中黏膜嵴，其原因可能是此处位置较低，喉腔中的黏液更多地汇集于底壁，因此此处粘附空气中的病原菌和颗粒物能力较强，另外正中黏膜嵴在此处突出，与经过喉口进入喉腔的气体接触频繁，因此接触病原的概率较大，并且此处黏膜较厚，固有层中血管等较发达，从而使免疫细胞较易在此处定殖，从而行使免疫功能。Casteleyn 等[8]对犊牛研究发现，在喉的会厌和杓状软骨突起部分黏膜中存在大量淋巴滤泡。犊牛喉腔中这些突起部位存在大量淋巴组织恰好与本研究发现的在鸡喉腔底部突起的正中黏膜嵴中存在淋巴聚集物相似，也主要是由于这些突出部位会与经过喉口进入喉腔的气体频繁接触，因此接触病原概率较大，从而使免疫细胞较易在此处定殖，形成较为发达的淋巴组织。

14 日龄时，在喉口黏膜上皮转换处，两种黏膜上皮下淋巴细胞的分布截然不同，口腔侧的复层扁平上皮下几乎没有Bu-1+B 淋巴细胞存在，而在喉腔侧的呼吸性假复层柱状纤毛上皮下聚集了大量淋巴细胞，并形成淋巴聚集物。这说明喉口处是喉部免疫的重要部位，作为气体进出的门户，位于喉腔侧的呼吸性假复层柱状纤毛上皮下的淋巴聚集物对抵御空气中的病原菌起着重要作用，此处的淋巴组织可能更倾向于是喉部免疫的诱导位点，关于其具体的免疫机制还有待于进一步研究。

56 日龄时，黏膜固有层底端出现主要由Bu-1+B 淋巴细胞构成的生发中心，而CD3+T 淋巴细胞则分布在生发中心周围的滤泡间区域。由此可以证明，鸡喉黏膜中的淋巴组织具有了黏膜相关性淋巴组织（MALT）的一般形态学和组成特征，属于MALT 的一部分，可以命名为喉相关淋巴组织（LALT）。本研究也是对鸡喉部淋巴组织进行的首次研究，以后对于其免疫机制还将继续展开研究。与本研究相似，Kracke 等[9]对人的研究发现，在儿童喉的声门区域有发达LALT 存在，这些淋巴组织中有淋巴细胞密集分布的淋巴聚集物，黏膜上皮中有淋巴细胞浸润。淋巴聚集物也主要由B 淋巴细胞组成，其中也含有少量CD3+T 淋巴细胞。