狮源猫细小病毒分离鉴定及其VP2 基因序列分析

吕梦娜，韦柳明，单 芬，彭仕明，陈 武，翟俊琼

（1.广州动物园，广州市野生动物研究中心，广东广州 510070；2.华南农业大学兽医学院，广东广州 510642）

猫细小病毒（feline parvovirus，FPV）又名猫泛白细胞减少症病毒（feline panleukopenia virus），是造成动物患上猫泛白细胞减少症（feline panleukopenia，FPL）的病原[1]。FPL 是一种高度传染性和致死性疾病，其临床特征是急性肠炎，出现严重脱水和败血症，以淋巴衰竭和全血细胞减少为显著特征[2-3]。FPV 已经被欧美地区多个国家定义为严重的猫传染病之一。1957 年Bilin 首次分离培养出该病毒，1964 年Johnson 从豹的脾脏中也分离出FPV[4]。

FPV 是无囊膜的单股DNA 病毒，其病毒粒子直径为20～24 nm，呈二十面体对称结构。

FPV 的衣壳蛋白由VP1、VP2、VP3 组成，其中VP2 占90%，为最主要的结构蛋白，决定宿主范围和病毒与宿主的相互作用[5]。FPV 基因组全长4～6 kb，相对分子质量为（1.5～2.0）×106。FPV 在自然界中分布极为广泛，对外界因素抵抗力强[6]，60 ℃加热30 min 不能使其完全灭活；对乙醚、氯仿和丙酮等脂溶性溶剂和酸、碱、酚（0.5%）及胰蛋白酶都有抵抗力，0.2%～0.5%甲醛溶液处理20～24 h 能够使其灭活，0.5%福尔马林和0.175%次氯酸钠能有效将其杀灭[7-8]。

研究表明，FPV 在自然条件下可感染虎、豹、狮等大型猫科动物[3，9-12]，而小型猫科动物和水貂最易感[13]。国外研究者还曾对俄罗斯远东地区的野生东北虎进行FPV 抗体检测，发现抗体阳性率很高[14]。在我国，FPV 全年流行，尤其是冬季及初春季节。目前，国内对狮源FPV 的研究较少。为此，本研究通过细胞培养从非洲狮粪便中分离得到1 株FPV，并对其VP2基因进行扩增和序列分析，以了解FPV 的遗传进化情况，对该病的诊断和治疗提供依据，也为后期相关疫苗的研制打下基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、病料及主要试剂

本研究所用的猫肾细胞F81，由华南农业大学兽医学院微生物教研室馈赠，由本实验室培养和冻存；病料，由广东省某动物园提供，且经胶体金试纸条检测为细小病毒阳性；病毒总RNA/DNA 提取试剂盒，购自AXYGEN；胶回收试剂盒，购自OMEGA；pMDTM19-T 载体、反转录试剂盒、ExTaq酶、DH5α 感受态细胞，均购自TAKARA；胎牛血清、DMEM 培养基、PBS 缓冲液和0.25%胰蛋白酶，购自Gibco。

1.2 引物设计

登录NCBI 查找细小病毒序列，用Primer premier 5.0 设计并合成2 对特异性引物。其中：1对为鉴定细小病毒引物，目的条带大小约为600 bp（F1：5'-AAAGAGTAGTTGTAAATAATT-3'；R1：5'-CCTATATAACCAAAGTTAGTAG-3'）；1 对为扩增细小病毒VP2基因引物，目的条带大小约为1 800 bp（F2：5'-ATGAGTGATGGAGCAGTTCA-3'；R2：5'-GGAATATAATTTTCTAGGTGCTAGT-3'）。2 对引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.3 病料收集与处理

采集广东省某动物园疑似感染FPV 的非洲狮粪便，用适量已灭菌的PBS 稀释成悬液并加入青、链霉素，涡旋振荡后12 000 r/min 4 ℃离心10 min，取上清液经0.22 μm 过滤除菌后-80 ℃保存备用。

1.4 病毒分离培养与鉴定

常规方法培养F81 细胞，待细胞长满单层后，弃培养基，用PBS 小心清洗后，加入0.25%的EDTA 胰蛋白酶进行消化，待细胞逐渐脱落时，加入含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM 培养基终止消化并吹打均匀。细胞传代的同时，在培养液中按体积比1/10 的量接种处理好的病毒滤液，同时设立不接毒的对照组，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞长至80%左右，若还未产生细胞病变（CPE）则将培养液更换为含2%胎牛血清、1%双抗的DMEM 培养基，继续观察3～4 d，每天观察有无产生CPE；若无CPE，盲传4～5 代，仍无弃之。若出现CPE ≥80%，则反复冻融3 次收毒，提取细胞培养物DNA，使用鉴定引物按照25.0 μL反应体系（Primemix ExTaq酶12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL）进行PCR 扩增（95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共30 个循环；最后72 ℃终延伸10 min），产物经1.0%琼脂糖凝电泳观察结果。若条带大小相符，送至北京擎科生物科技有限公司测序。

1.5 VP2 基因扩增、测序及序列分析

以1.4 中提取的DNA 为模板进行PCR 反应，扩增VP2基因序列（反应体系、程序以及操作同1.4）；电泳后切胶回收目的条带大小的产物，将其连接到pMDTM19-T 载体，转化至DH5α 感受态细胞后，涂布于含Amp+的LB 平板；待平板上形成肉眼可见的单个菌落后，挑取单个菌落摇菌提取质粒，将鉴定为阳性的质粒送至北京擎科生物科技有限公司测序。将测序结果与NCBI 上的26 个序列（表1）进行比较，用软件MEGA 6.06 分析本研究得到的VP2基因与参考毒株的遗传进化规律，用MegAlign 分析核苷酸序列同源性。

表1 参考毒株信息

2 结果

2.1 病毒分离与鉴定

病毒滤液接种F81 细胞，盲传至第3 代，48 h后细胞发生典型病变，表现为细胞拉丝现象，随后，细胞间隙慢慢变大，逐渐脱落（图1）。经细小病毒特异性引物PCR 扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测，在600 bp左右处出现特异性条带且对照组为阴性，与预期目的条带片段大小一致（图2），测序结果经比对确定为FPV，并将该毒株命名为FPV CHNHN-1。

图1 细胞接毒培养结果

图2 病毒培养液PCR 鉴定结果

2.2 VP2 基因序列扩增与测序

经细小病毒VP2特异性引物扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测，发现在1 800 bp 左右处出现特异性条带，与预期目的条带大小一致（图3），经连接、转化后，提取质粒、测序、拼接得到FPV CHNHN-1 毒株的VP2基因序列。

图3 VP2 基因扩增结果

经序列分析发现，FPV CHN-HN-1 毒株VP2蛋白的6 个决定宿主差异的氨基酸位点80、93、103、323、564 和568 位均未发生改变（图4），而当80、564 和568 位分别为赖氨酸、天冬酞胺和丙氨酸时，细小病毒只能在猫科动物体内增殖。

图4 VP2 基因测序峰图

2.3 VP2 基因序列分析

将FPV CHN-HN-1 的VP2基因序列与GeneBank 上公布的26 株参考株VP2基因序列进行同源性比对。由图5 可知，分离株FPV CHNHN-1 与GeneBank 上公布的其他26 株毒株同源性在97.8%～100%，其中与JN-FPV-96（MZ836373.1）、TZ-FPV-112（MZ836368.1）、FPV-SH2003（MW811187.1）、BJ051（MT270580.1）相似性最高，均为100%；而与98-10SA2010（HQ602986.1）、118/2010（KF373598.1）相似性最低，均为97.8%。

图5 VP2 基因核苷酸同源性分析结果

2.4 VP2 基因遗传进化树分析

使用MEGA6.06 软件将FPV CHN-HN-1 毒株与国内外26 株细小病毒VP2基因核酸序列进行比对，构建遗传进化树。结果（图6）显示，FPV CHN-HN-1 株与其他7 株FPV 同属一个大的分支，与JN-FPV-96、TZ-FPV-112、FPV-SH2003、BJ051遗传距离最近，与其他犬源和狐源的细小病毒参考毒株遗传距离较远。

图6 基于VP2 基因的遗传进化树

3 讨论

FPV 是一种单链DNA 病毒，在家养动物和野生动物中均有流行，动物感染后出现高热、急性肠炎、呕吐、白细胞减少和心肌炎等症状，对犬、猫、鼬等家养、圈养、经济动物及野生猫科动物的危害十分严重。江苏、安徽、湖北等10 余个省市都曾发生过FPV 感染事件[15-16]。近年来，由于家养犬、猫等动物疫苗的使用，细小病毒病得到很好地控制，但在野生动物中还时有发生[17-18]。曾有学者用血凝抑制试验（HI）对我国某野生动物园圈养虎进行FPV 血清学调查，发现抗体阳性率接近50%[8]；2017 年李同义等[19]报道某动物园东北虎和非洲狮感染细小病毒。可见，大型猫科动物如虎、狮感染该病毒也十分普遍。到目前为止，国内虽然有关于虎细小病毒序列的分析报道，但暂未有狮源细小病毒序列的相关分析报道，因此应加强大型猫科动物FPV 监测，以减少该病的发生与流行。

VP2 蛋白是FPV 主要的抗原蛋白，其非常保守，与病毒的血凝特性、致病性密切相关。本研究成功从疑似感染FPV 的非洲狮粪便中分离出FPV CHN-HN-1 毒株。对该分离株的VP2基因进行PCR 扩增测序，并分析其遗传变异情况，结果发现分离株与26 株参考株的序列相似性为97.8%～100%，与JN-FPV-96、TZ-FPV-112、FPVSH2003、BJ051 高度同源，相似性均为100%，同时决定分离株VP2 蛋白的6 个关键氨基酸位点均未发生突变，这符合FPV 的序列特征。遗传进化分析显示，FPV CHN-HN-1 与其他7 株猫源细小病毒同属一个分支，表明本株狮源FPV 与猫源FPV病毒亲缘关系较近，与犬源和狐源的细小病毒株亲缘关系较远，遗传进化分析进一步证明分离株FPV CHN-HN-1 起源于FPV。

动物园作为大型圈养猫科动物的主要活动场所，除了在动物早期进行免疫预防接种，加强环境消毒外，还应做好FPV 分子流行病学和遗传变异机制研究，以便对该病的诊断和治疗提供依据，也为后期相关疫苗的研制打下基础，同时对野生动物保护也具有重要意义。