鸭坦布苏病毒荧光定量RT-PCR 方法的建立及应用

王巧萍，严红亚，李 珂，朱鹤然，元正菊，常志顺，张以芳，信爱国

（1.云南农业大学动物医学院，云南昆明 650201；2.云南省畜牧兽医科学院养禽与禽病研究所，云南昆明 650224）

鸭坦布苏病毒病是一种由鸭坦布苏病毒（duck tembusu virus，DTMUV）引起的传染病。它于1955 年被发现，2010 年传入我国，且在我国东南部地区大范围扩散，造成了至少数十亿的经济损失[1-2]。该病主要危害鸭和鹅，以产蛋量持续下降为主要特征[3]，降至低谷后由于机体康复而慢慢恢复，但种蛋的受精率和孵化率受到极大影响[4]。病鸭还表现为不爱下水、采食量下降，种鸭在恢复后期大多出现换羽现象[5]。感染鸭剖检最明显的病变主要见于卵巢，可见卵泡充血、出血、变性和萎缩，发生卵黄性腹膜炎[6]，输卵管覆盖黏液等，肺和脾脏肿大出血[7]；部分病例可见肝脏表面有针尖状白色坏死点、出血、淋巴细胞渗出和增生[8]；脑组织水肿、出血、呈树枝状充血，偶见胰腺出血和坏死，心脏内膜出血；部分患病鸭盲肠内容物呈绿色或黑色，有的可见霉斑附着[9]。本病病程较长，严重者可出现死亡，但死亡率较低[10]。

该病在我国大多数养鸭地区均造成了一定经济损失，因此建立一种快速而灵敏的检测方法极为重要。其临床诊断主要是观察症状及制作病理切片，但是通过观察很难与其他引起相似症状的疾病做区分，而制作病理切片耗时较长，因此需要将临床诊断与实验室诊断相结合。目前可用于DTMUV 的实验室诊断方法有病原学诊断、血清学诊断、分子生物学诊断等。病原学诊断中的病毒分离鉴定耗时长，技术难度大[11]，对试验人员安全有一定程度威胁；血清学检测耗时费力，在临床诊断方面局限性较大，病毒分离鉴定和血清学诊断的敏感性和特异性都较差；普通RT-PCR 检测费时较多，过程中包含变性、退火、延伸等阶段，较为复杂，且敏感性较低，而qRT-PCR 技术具有高通量、花费时间少等优点[12]，是一种成熟的核酸扩增技术，自问世以来在病毒检测上发挥着极大作用[13-14]。

DTMUV 基因组包含一个开放阅读框（ORF），编码3 种结构蛋白（C、PrM/M、E）和7 种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）。其中NS5 蛋白具有RNA 依赖的RNA 聚合酶活性，而且是黄病毒中最保守的非结构蛋白，因此试验基于DTMUV 的保守基因NS5建立了MGB 探针qRT-PCR 检测方法，可从病料中快速检测出DTMUV，具有特异性强、灵敏性高、花费时间少等优点，为该病的防控和诊断提供了可靠方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒与细胞 DTMUV YN2019 株BHK-21 细胞适应毒，由本研究所分离并保存；新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、Ⅰ型和Ⅲ型鸭肝炎病毒（duck hepatitis virus，DHV）、传染性法氏囊病毒（infectious bursal disease virus，IBDV），均由本研究所保存；H5、H7 和H9 亚型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）灭活抗原，购自华南农大生物药品有限公司。

1.1.2 主要试剂和仪器 病毒RNAiso Plus试剂，购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA 凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；pEASY®-T1 Cloning Kit、Trans Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix 试剂盒，购自北京全式金公司生物技术有限公司；One Step PrimeScriptTMRTPCR Kit（Perfect Real Time），购 自TaKaRa 公司；LightCycler 96 Real-time RT-PCR 扩增仪，购自Roche Diagnostics 公司。

1.2 引物、探针设计与合成

根据已发表的DMTUVNS5基因序列（登录号：KJ958533），采用VectorNTI 8.0 序列分析软件做对比分析，利用Primer 5.0 软件自主设计了2对针对NS5基因的检测引物和1 条MGB 探针。RT-PCR 检测引物同时用于制备标准阳性质粒，在探针的5'和3'端分别标记FAM 荧光报告基团和MGB 非荧光淬灭基团。引物序列见表1，所有引物均由硕擎生物科技有限公司合成，并稀释成工作浓度（10 pmol/L）置于-20 ℃保存备用。

表1 DTMUV 引物信息

1.3 阳性标准品制备

将保存的DTMUV 细胞毒、NDV、Ⅰ型和Ⅲ型DHV、AIV 灭活抗原（H5、H7、H9 亚型）分别取200 μL，用病毒RNAiso Plus 试剂提取核酸。然后用DTMUV-uF/uR 引物对DTMUV 核酸进行RT-PCR 扩增。扩增体系为50.0 μL：Prime Script 1step Enzyme Mix 2.0 μL，2×1 step Buffer（Dye plus）25.0 μL，DTMUV-uF/uR 各1.0 μL，total RNA 2.0 μL，RNase-free ddH2O 19.0 μL。反应程序：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共进行35 个循环；72 ℃ 15 min，最后4 ℃冷却。RT-PCR 结束后，取5.0 μL 产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳30 min，然后用凝胶成像系统进行初步鉴定。

对凝胶电泳产物按照DNA 凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收纯化，然后按照pEASY®-T1 Cloning Kit 说明书将扩增片段连接至pEASY®-T1克隆载体；将连接产物转化到Trans1-T1 感受态细胞中，挑选平板上的单个克隆菌落置于7 mL LB液体培养基（含氨苄青霉素）中进行过夜扩大培养。菌液经PCR 鉴定为阳性的克隆送擎科生物科技有限公司测序，挑选测序正确的质粒按照质粒小量提取试剂盒说明书提取质粒DNA，经PCR 鉴定为阳性的质粒DNA 用核酸定量仪测定其浓度。

1.4 qRT-PCR 方法及标准曲线建立

按照TaKaRa 公司One Step PrimeScriptTMRTPCR Kit（Perfect Real Time）说明书，进行qRTPCR 体系配置及扩增。扩增体系为20.0 μL：2×One Step RT-PCR Buffer II 10.0 μL，TaKaRa ExTaqHS（5 U/μL）0.4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.4 μL，DTMUV-qF/qR（10 pmol/L）各0.4 μL，DTMUV-qP 0.3 μL，RNA 2.0 μL，最后用RNase-Free ddH2O 补足到20.0 μL。扩增程序：42 ℃5 min，95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40 个循环。

标准曲线建立：将1.3 中制作好的阳性标准品测定浓度后，通过10 倍连续梯度稀释作为标准模板，共设置108～102copies/μL 7 个浓度梯度，同时设立空白对照，试验进行3 次平行重复，建立DTMUV qRT-PCR 检测方法的标准曲线。

1.5 MGB 探针法qRT-PCR 引物特异性验证

为探明MGB 探针法qRT-PCR 的引物是否有非特异性扩增及产物是否单一，将DTMUV 核酸用剔除MGB 探针后的SYBR Green I 染料法进行扩增，并比较两种情况下的熔解曲线。MGB 探针法qRT-PCR 按照1.4 中的步骤进行。

SYBR Green I 染料法qRT-PCR 具体如下：将DTMUV RNA 按照Trans Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix 试剂盒说明书，进行以下20.0 μL 反转录体系配置：Random Primer（0.1 μg/μL）1.0 μL，2×TS Reaction Mix 10.0 μL，gDNA Remover 1.0 μL，RNase-Free ddH2O 4.0 μL，Trans Script RI/RT Enzyme Mix 1.0 μL，最后加入RNA 3.0 μL。反转录于普通PCR仪中进行，程序为25 ℃ 10 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，最后4 ℃冷却。

用反转录好的cDNA 配置SYBR Green I 20.0 μL体 系：DTMUV-qF/qR（10 pmol/L）各0.4 μL，2×Perfect StartTMGreen qPCR Super Mix 10.0 μL，RNase-Free ddH2O 7.2 μL，最后加入cDNA 2.0 μL。qRT-PCR 程序：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s；54 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40 个循环。在LightCycler 96 qRT-PCR扩增仪中开展扩增。

1.6 qRT-PCR 和普通RT-PCR 敏感性试验

对1.3 中制备的DTMUV 阳性质粒测定浓度后，用RNase-Free ddH2O 进行10 倍梯度倍比稀释（100～10-7copies/μL），按1.4 中的步骤和体系进行qRT-PCR 反应，以确定其最低检出量；普通RTPCR 用DTMUV YN2019 株提取的RNA 进行梯度稀释，按1.3 中的程序进行，结束后进行核酸电泳查看结果。

1.7 qRT-PCR 特异性试验

对DTMUV YN2019 株、I 型和III 型DHV、NDV、AIV 灭活抗原（H5、H7、H9 亚型）提取的核酸样品，进行qRT-PCR 扩增，以验证其特异性。

1.8 重复性试验

将DTMUV 阳性标准品进行10 倍梯度稀释为7 个浓度梯度（108～102copies/μL），用建立的qRT-PCR 方法检测，每个浓度重复3 次。在试验的第1、3 和5 天重复检测3 次为批间重复试验，在同一天的早、中、晚3 个时段重复检测3 次为批内重复试验。根据Cq 值计算批内和批间的平均值、标准差（standard deviation，SD）和变异系数（coefficient of variation，CV），以验证其重复性和稳定性。

1.9 临床样品检测

从云南不同地区的养鸭场收集20 份有产蛋下降临床疑似症状的样品，将每份样品取约5.0 g 剪碎；加入与样品体积比为1:4 的PBS（pH7.2），用研钵研磨，反复冻融3 次并低速离心；取上清提取总RNA 并按照1.4 中的qRT-PCR 方法进行检测，以确定其临床适用性。

2 结果

2.1 标准曲线建立

经核酸定量仪测定可知，DTMUV 阳性质粒浓度为355.85 ng/μL，根据公式计算得出拷贝数为3×109copies/μL。先 用RNase-Free ddH2O 将 其稀释至1×109copies/μL，再进行连续10 倍倍比稀释，使其浓度为108～102copies/μL。以质粒标准品浓度的对数为x轴，以Cq 值为y轴，绘制回归方程，可得到DTMUV qRT-PCR 标准曲线（图）1，其相关系数R2=0.999 3，扩增效率E=1.93，回归方程为y=-3.513 3x+32.125，具有良好的线性关系。

图1 qRT-PCR 标准曲线

2.2 MGB 探针法qRT-PCR 引物特异性验证

将同一核酸样品通过MGB 探针法与无MGB探针的SYBR Green I 染料法扩增，比较两者的熔解曲线。结果显示：SYBR Green I 染料法扩增的熔解曲线出现尖峰状的单一曲线（图2），说明产物单一，无非特异性反应；而MGB 探针法的熔解曲线则不出现单一峰值，总体呈现波浪状（图3）。

图2 SYBR Green I 染料法熔解曲线的单一尖峰

图3 MGB 探针法的波浪状熔解曲线

2.3 qRT-PCR 和普通RT-PCR 敏感性试验

对制备的DTMUV 阳性质粒（浓度为355.85 ng/μL）连续10 倍稀释至100～10-78 个稀释度，进行qRT-PCR 检测。结果显示，最低检出量为10-7稀释度，即3×102copies/μL（图4）。经测定，DTMUV YN2019 株核酸浓度为32.4 ng/μL，普通RT-PCR 可检出的最低稀释度为10-3，因此普通RT-PCR 最低检出量为32.4 pg/μL（图5），即2.8×106copies/μL，说明qRT-PCR 的灵敏度比普通RT-PCR 高出约10 000 倍。

图4 qRT-PCR 检测DTMUV 不同稀释度质粒的敏感性试验结果

图5 不同稀释度DTMUV YN2019 株普通RT-PCR 检测结果

2.4 特异性试验

扩增曲线（图6）显示，使用建立的qRT-PCR方法仅对DTMUV 能扩增出特异性曲线，而对其他禽源病毒（DHV、AIV、NDV、IBDV）检测结果均为阴性。

图6 qRT-PCR 检测DTMUV 特异性试验结果

2.5 重复性试验

表2 qRT-PCR 重复性试验结果

2.6 临床样品检测

对云南不同地区养鸭场收集的20 份临床疑似样品提取RNA，采用qRT-PCR 方法进行检测，结果测定为阳性的有12 份，其阳性率为60%，而普通RT-PCR 的阳性率仅为50%，两者符合率为90%（表3），说明qRT-PCR 检出率更高，更适合于临床样品检测。

表3 临床样品检测结果

3 分析与讨论

本试验针对DTMUVNS5基因设计了特异性引物和MGB 探针，建立了DTMUV 的qRT-PCR检测方法。用普通RT-PCR 扩增后进行T-A 克隆构建重组质粒，并用其制作了标准曲线；用SYBR Green I 染料法验证了MGB 探针法引物是否会产生非特异性扩增，对qRT-PCR 检测方法的特异性、敏感性、重复性进行了验证，并将其应用于临床样品检测。

SYBR Green I 是一种可与所有ds DNA 双螺旋小沟区域非特异性结合、具有绿色激发波长的染料，其在游离状态下仅发出微弱荧光，但是与双链DNA 结合后荧光信号将会大大增强[15]。实际上其通过荧光信号直观反映了模板数量：在反应最初双链DNA 产生的量少，SYBR Green I 染料与之结合也较少，因此收集到的荧光信号较弱；由于积累效应，在某一时刻双链DNA 量可达最高值，染料与之大量结合并发出荧光信号；双链DNA 逐渐消耗染料，在两者的量都减少的同时荧光信号也逐渐变弱，两者的反应在整个核酸扩增过程中大体上呈现正态分布。由于SYBR Green I 染料法的非特异性，在临床上产生假阳性的概率极大，所以通常需要绘制熔解曲线来确定反应产物。

MGB 探针诊断技术基本原理是碱基互补配对原则。通过在探针5'端标记FAM 荧光报告基团，在3'端标记MGB 非荧光淬灭基团，利用Taq酶的5'—3'聚合酶活性和3'—5'外切酶活性，根据能量共振转移原理，当整个MGB 探针完整存在时，荧光信号被外切核酸酶3'端淬灭基团吸收，不能发出荧光，只有探针和目的基因特异性结合时，即探针被分解后，5'荧光物质便会游离出来发出荧光，荧光检测系统接收到荧光信号，进而能够实现荧光信号的累积，PCR 产物形成量与荧光信号的累积和收集处于完全同步状态[16]，即探针法根据荧光信号值的变化可以实时检测每一轮扩增过程中循环产物的变化量，所以探针法的熔解曲线并不是单一的尖峰状，而是波浪形，其无法证明引物的特异性，所以结合SYBR Green I 染料法证明了试验中的MGB 探针法的产物单一，熔解曲线单一，且无非特异性扩增。

用标准阳性质粒绘制的标准曲线线性关系显著，其相关系数R2=0.999 3，扩增效率E=1.93，回归方程为y=-3.513 3x+32.125；普通RT-PCR 重复性良好，qRT-PCR 批内重复性和批间重复性的变异系数为0.08%～0.49%，均小于0.5%，说明两者的重复性和稳定性均良好。有国内学者[17-20]报道建立的TaqMan 探针法的批内变异系数和批间变异系数均大于0.5%，标准曲线的扩增效率E均小于1.93，这表明本试验建立的标准曲线线性关系较前人的好，且该方法的重复性和稳定性也更好。

特异性检测结果显示该方法只能检出DTMUV，对于NDV、I 型和III 型DHV、IBDV、H5/H7/H9 亚型AIV 灭活抗原则均不能检出，表明其特异性良好；于春梅等[21]建立的SYBR Green I染料法需要设立内参基因β-actin，而且存在反转录过程，过程中增加了核酸和引物被污染的概率；且SYBR Green 染料既能与特异性产物结合，也能与非特异性产物结合[22]，其假阳性高于MGB 探针法，故MGB 探针法的特异性也更强。

本试验建立的qRT-PCR 可检测的最低限度为3×102copies/μL，普通RT-PCR 的敏感性为2.8×106copies/μL，说明qRT-PCR 的敏感性是普通RT-PCR 的约10 000 倍；应用该方法检测20 份相同的临床样品，qRT-PCR 检出12 份为阳性，其阳性率为60%，而普通RT-PCR 只检出10 份为阳性，其阳性率为50%，说明qRT-PCR 的检出率更高，更适合于临床样品检测；在150 min 内qRTPCR 能够完成所有检测过程，而普通RT-PCR 则需要240 min 才能完成，万春和等[23]建立的SYBR Green I 染料法整个过程也需花费240 min，以上数据说明本试验建立的qRT-PCR 花费时间更短，检出率更高，敏感性更强。

综上所述，本试验针对DTMUV 保守基因NS5建立的MGB探针qRT-PCR具有良好的敏感性、特异性和重复性，耗时少，适用于临床样品检测，可为DTMUV 的临床检测和监控提供技术手段。