高效液相色谱法测定花椒中吡虫啉的残留量

杜 平，李浩浩

（眉县食品安全检验检测中心，陕西眉县 722301）

吡虫啉（分子式C9H10ClN5O2）是烟碱类超高效杀虫剂，吡虫啉可有效防治粉虱、叶蝉、蚜虫、蓟马、负泥虫、潜叶蝇等刺吸式口器害虫。在花椒开花前和坐果后打药防虫效果最佳。目前吡虫啉是花椒防虫中使用最广泛的杀虫剂。近年来关于花椒中吡虫啉残留量超标事件，引起了人们的关注。2016 年台湾地区检出大陆出口花椒中吡虫啉的残留量0.14 mg/kg[1]。依据农药残留容许量标准，吡虫啉的残留量为0.05 mg/kg。韩国进口食品2020 年6 月12 日，韩国食品药品安全部（MFDS）发表消息称，韩国进口食品等进口、销售企业大华MP（株）从中国上海进口、销售的花椒中检出吡虫啉超标[2]。《水果、蔬菜及茶叶中吡虫啉残留量的测定高效液相色谱法》（GB/T 23379—2009）对水果、蔬菜及茶叶中的吡虫啉残量的测定进行了规定，但缺少对花椒中吡虫啉残留量检测的国家标准。花椒中吡虫啉残留量检测分析方法目前国内研究的较少[3-6]。本文旨在探究花椒中吡虫啉残留量检测方法的有效性、准确性。经过笔者多次试验、研究，探索出了具有可操作性强、检测速度快、检测结果精准的操作方法，弥补了对花椒中吡虫啉残留量的检测方法的技术空缺。

1 材料和方法

1.1 仪器与设备

吡虫啉标准品（浓度100 µg/mL，农业部环境保护科研检测所）、乙腈（赛默飞）、甲醇（赛默飞）、二氯甲烷（天津赛孚瑞）、中性氧化铝固相萃取柱（艾杰尔）、氨基固相萃取柱（艾杰尔）、C18固相萃取柱（艾杰尔），高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher Umlit 3000）。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱型号：BDS HYPERSIL C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：30%乙腈水溶液；紫外检测器波长：270 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；进样量，10 µL。

1.2.2 样品前处理

（1）提取。将干花椒用高速均质机粉碎，准确称取5.0 g样品于100 mL 离心管中，加入10 mL 水浸泡5 min 后，依次加入5 g 氯化钠，50.0 mL 乙腈，涡旋提取2 min，超声10 min 后离心。取25.0 mL 乙腈层于鸡心瓶中旋转蒸至近干，加入5 mL 二氯甲烷∶甲醇（99 ∶1）溶液复溶。样品液待净化。

（2）净化。用5 mL 二氯甲烷∶甲醇（99 ∶1）溶液活化中性氧化铝固相萃取柱,将待净化样品液过活化后的中性氧化铝固相萃取柱，再用10 mL 二氯甲烷∶甲醇（99 ∶1）溶液分3 次冲洗鸡心瓶，将液体转移至活化后的中性氧化铝固相萃取柱，将滤出液体收集，氮吹至近干后加入1.0 mL 甲醇涡旋后过0.45 µm 有机膜上机。

1.2.3 加标回收

对花椒进行0.05 mg/kg、0.10 mg/kg、1.00 mg/kg，3 个浓度的加标回收实验，每个浓度重复处理3 次。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

使用不同浓度吡虫啉的标准工作液：0.1 µg/mL、0.4 µg/mL、0.8 µg/mL、1.6 µg/mL 和3.2 µg/mL，在上述色谱条件下，以各浓度对应的峰面积得出标准曲线见图1。由图1 可知，吡虫啉标准曲线回归方程为y=0.850 7x-0.017 2，R2=1.0。测定的样品浓度均在标准曲线范围内。

图1 吡虫啉标准曲线

2.2 流动相的选择

由图2 可知，GB/T 23379—2009 中使用的流动相为0.1%磷酸水与乙腈梯度，样品中目标峰与样品的杂峰混为一体分不开，不能将样品中的吡虫啉分离出来且分离时间较长。通过乙腈与水的不同比例（20 ∶80、30 ∶70、40 ∶60，V/V）调整目标化合物的出峰时间，最终选择流动相为乙腈∶水（30 ∶70）。样品基线平稳，目标峰分离效果好。

图2 两种流动相吡虫啉加标样品的液相色谱图

2.3 样品前处理方法的改进

①用二氯甲烷直接提取，吸取二氯甲烷氮吹至近干，用甲醇复溶上机测定；②样品中加入氯化钠、甲醇/乙腈进行提取，吸取甲醇溶液氮吹至近干，用二氯甲烷∶甲醇（99∶1）溶液复溶过固相萃取柱，收集滤液氮吹至近干，用甲醇复溶；③样品中适量水浸泡5 min,再依次加入氯化钠、乙腈进行提取，吸取乙腈层溶液氮吹至近干，用二氯甲烷∶甲醇（99 ∶1）溶液复溶过固相萃取柱，收集滤液氮吹至近干，用甲醇复溶。

根据吡虫啉的化学性质，吡虫啉在二氯甲烷的溶解度为50～100 g/L（20 ℃）。用第①方法，用二氯甲烷直接提取，但提取效果只有30%左右。吡虫啉有一定的极性，样品中的吡虫啉很难直接溶于二氯甲烷中，需用其他试剂将提取的溶液全部转化到二氯甲烷中。选用甲醇和乙腈两种有机试剂，还考虑到花椒的主要的风味特征“麻”“香”，其挥发油是香味物质的代表性成分。要对样品基质选择净化处理，选用了C18、氨基柱、中性氧化铝3 种固相萃取柱。净化不仅仅要除掉有机大分子，更要除去样品基质中存在挥发油类物质。选用第②方法比较了两种提取液甲醇、乙腈在这3 种固相萃取柱中的回收率。结果表明，乙腈比甲醇提取率要高。C18固相萃取柱和氨基柱对样品净化效果不明显，中性氧化铝可以有效地去除样品中的油脂大分子，无杂峰，分离效果好。但回收率在59.0%～71.3%，样品前处理中还是存在问题。考虑其样品中水分含量比较低，烘干后花椒水分小于10%。样品基质提取物较多，干扰较大，样品中水分不易分离。选用第③方法对样品前处理中先加入适量的水后在进行提取，实验表明该方法可以有效提高其提取效率。对样品中添加不同水量比较其样品回收率结果如表1。

表1 不同加水量对花椒提取效果回收率比较

花椒的前处理过程中先要加入适量蒸馏水浸泡，再依次加入氯化钠、乙腈进行提取，氯化钠在乙腈中的溶解能力很弱，易溶于水。含盐的水溶液会降低原来可溶于水的溶剂的溶解度。有利于乙腈与水的分层，使农药残留目标物更完全地溶于乙腈中。洗脱液选用二氯甲烷，吡虫啉有一定的极性，用纯的二氯甲烷复溶效果不好。不同比例的二氯甲烷∶甲醇，会直接影响洗脱效果，如表2 可知，当甲醇体积分数为1%～9%时，吡虫啉的回收率比较稳定。二氯甲烷与甲醇（99 ∶1）相结合时，吡虫啉可以完全吸收。

表2 甲醇在二氯甲烷中的不同比例回收率的比较

3 结论

韩国和欧盟颁布的花椒中吡虫啉残留量限量标准要求0.05 mg/kg。本实验中采用高效液相色谱测定方法。经过笔者多次对样品前处理不断进行优化，得出了检测花椒中吡虫啉残留量的最佳前处理处理方法及样品前处理中的加水量。添加浓度在0.05～1.00 mg/kg 内线性关系良好，方法回收率高、准确度高均符合要求。实验研究的方法能将吡虫啉和杂质完全分离。样品前处理过程中操作便利性强、检测时间短，并且检测结果精准。可以为测定花椒中的吡虫啉残留量提供借鉴和参考。