环状RNA在胶质瘤中的研究进展△

刘超，吴文松，孙程圆，何秋果，郑克彬

河北大学附属医院神经外科，河北 保定 071000

神经胶质瘤是中枢神经系统中常见的恶性肿瘤，占全部恶性脑肿瘤的80%以上，具有高发病率和高病死率的特征，中位总生存期为37.6个月。尽管在胶质瘤治疗中，手术治疗联合放疗或化疗取得进展，但是患者复发率较高，预后较差，其原因除了胶质瘤细胞增殖快、侵袭广、肿瘤内和肿瘤间遗传异质性、治疗耐药外，还源于对分子发病机制认识不深，缺乏及时诊断的手段。因此，阐明胶质瘤发生发展的分子机制，以及进一步探索可靠的诊断和治疗方法是至关重要的。

环状 RNA（circular RNA，circRNA）是一种具有共价闭环结构的新型RNA，是近年来非编码RNA研究领域的新热点。早在20世纪70年代，在病毒中就首次发现了少数这种RNA，并认为它们是RNA剪接中产生的错误产物。然而，随着RNA测序技术和生物信息学的不断发展，Memczak等和Hansen等在circRNA生物学功能研究方面取得突破，首次提出circRNA可以作为miRNA的分子海绵进行基因表达的调控，并在转录后过程中发挥作用。此后，circRNA开始受到公众的广泛关注，并对其生物特征、功能机制以及在临床诊断和治疗中的潜在应用进行了相关研究。目前，越来越多的circRNA被发现在转录、转录后和翻译水平调控基因表达，它们通过调节选择性剪接、海绵化miRNA、抑制功能性蛋白、编码蛋白等参与胶质瘤的病理过程。多种circRNA在胶质瘤中异常表达，circRNA在胶质瘤的生长、转移、复发和治疗耐药性中发挥重要作用。鉴于circRNA具有高丰度、稳定性、保守性和组织特异性，并且广泛存在于各种体液中，因此探索胶质瘤相关的circRNA作为生物标志物或靶点，将为胶质瘤的早期诊断、预后和有效治疗做出重要贡献。本文就circRNA的生物起源、生物学特性和功能进行综述，重点介绍circRNA与胶质瘤的关系及其在治疗中的临床意义。随着对circRNA与胶质瘤关系认识的加深，将会发现更多关于胶质瘤进展的分子机制，并为胶质瘤的诊治提供新的治疗策略。

1 circRNA的概述

1.1 circRNA的生物起源

目前所发现的circRNA主要存在于细胞质中，并且具有组织特异性。circRNA的组成主要包括3种，由外显子拼接组成的circRNA（exon circRNA，ecircRNA），仅由内含子组成的circRNA（circular intron RNA，ciRNA），以及同时由外显子和内含子而组成的circRNA（exon intron circRNA，EIciRNA）。

ecircRNA能够竞争性地与miRNA结合，从而影响下游基因的表达。ecircRNA的生物合成主要通过套索驱动、内含子配对驱动和RNA结合蛋白（RNA binding protein，RBP）驱动的环化来实现，但研究表明内含子配对驱动的环化是合成ecircRNA最常见的方法。EIciRNA被认为是ecircRNA形成的中间产物，研究表明，EIciRNA是内含子与外显子稳定保留的结果，与ecircRNA不同，ciRNA和EIciRNA可调节RNA聚合酶Ⅱ和U1小核糖核蛋白的相互作用。

1.2 circRNA的生物学特性

细胞中circRNA生物学特性包括高丰度性、高度保守性、稳定性以及时空特异性。

1.2.1 高丰度性circRNA分布广泛，具有高丰度性的特性。在人成纤维细胞中已鉴定出25 000多种不同的circRNA，其中有14.4%的活跃转录基因可以产生ecircRNA。某些circRNA的丰度是线性RNA的十倍以上。此外，在人类、小鼠、植物、古生菌、线虫等多种物种中同样也发现了circRNA。

1.2.2 高度保守性circRNA在真核生物中表达，在不同的物种中呈现出进化上的保守性。到目前为止，已经在人和鼠之间鉴定出69种反向剪接高度保守的circRNA。对3种类型circRNA序列的保守性进行研究，发现由外显子组成的ecircRNA总体保守，由内含子组成的ciRNA与同时含有内含子和外显子的EIciRNA也表现出高度的保守性。

1.2.3 稳定性circRNA具有很高的稳定性，circRNA的共价闭合能抵抗RNaseR、脱支酶以及RNA外切酶的降解，并且比线性转录本更稳定。circRNA在细胞中的平均半衰期超过48 h，比mRNA的半衰期（﹤10 h）长得多。

1.2.4 时空特异性circRNA在同一生物的不同发育阶段、同一发育阶段的不同部位均表现出表达差异性，这样的差异丰富了生物多样性，揭示了分子生物学的研究中生物机体运转的高效性。

1.3 circRNA的功能

circRNA与传统非编码RNA有许多共同的功能。目前已报道circRNA的5种功能模型：①circRNA作为“miRNA海绵”，竞争性结合内源性miRNA；②circRNA作为“蛋白质海绵”，竞争性结合内源RNA结合蛋白；③circRNA作为“编码RNA”，能够直接编码多肽或蛋白质；④circRNA作为“蛋白质支架”而发挥作用；⑤circRNA具有“朊病毒样的功能”，能够通过催化二级结构的改变，进而表现出朊病毒样的活性。

1.3.1 circRNA作为miRNA海绵发挥作用 竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）属于非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）一般功能的家族成员之一，一些ceRNA可以竞争性地结合miRNA，从而阻止miRNA与其靶向的RNA结合，进而抑制这些miRNA的功能，称为circRNA的miRNA海绵功能。

1.3.2 circRNA作为蛋白质海绵发挥作用circRNA还可作为蛋白质海绵，结合某些RNA结合蛋白，进而影响其蛋白质的功能和作用。circRNA蛋白质海绵的一个典型例子是circMBL，circMBL及其两侧的内含子含有几个MBL结合位点，该circRNA能竞争性地与MBL蛋白结合，影响MBL蛋白的功能。

1.3.3 circRNA可以直接翻译成多肽或蛋白质circRNA也具有编码蛋白的潜力，Yang等报道了circRNA的翻译被m6A修饰，在细胞质中，m6A结合蛋白YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白3（YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 3，YTHDF3）和真核翻译起始因子4γ2（eukaryotic translation initiation factor 4 gamma 2，EIF4G2）促进 m6A 修饰circRNA的翻译。Legnini等报道称，circZNF609可以通过一种“非帽依赖”的翻译机制进行翻译。Zhang等报道称circSHPRH也具有编码能力，其翻译的肽可以抑制胶质瘤的进展。

1.3.4 circRNA作为蛋白质支架的功能circRNA作为蛋白质支架，为蛋白质间的相互作用以及形成蛋白质功能复合物提供了场所。Li等报道了EIciRNA能与抗U1小核糖核蛋白抗体（U1 sn-RNP）结合，促进U1 snRNP与RNA聚合酶Ⅱ的结合，使得EIciRNA能作为U1 snRNP和RNA聚合酶Ⅱ复合物的蛋白质支架，进而增强宿主靶基因的转录。

1.3.5 circRNA具有朊病毒样活性 核酶是一种可以催化特定生化反应的分子，circRNA具有像核酶一样的功能。Badelt等报道了一种功能类似于朊病毒的circRNA分子，在这项研究中，作者设计了一种circRNA，它可以通过相互作用而触发分子的自我催化复制，这项研究证明了circRNA也可能具有与朊病毒或核酶一致的特性。

2 circRNA在胶质瘤中的作用及机制

2.1 circRNA与miRNA相互作用调节胶质瘤进展

在胶质瘤中，circRNA与miRNA的相互作用是很常见的现象。据报道，hsa_circ_0000177在胶质瘤组织中表达上调，荧光素酶实验证实了hsa_circ_0000177可作为靶向miRNA-638的海绵，结果表明，卷曲类受体7（frizzled class receptor 7，FZD7）是miRNA-638的靶基因，并被hsa_circ_0000177上调。进一步研究发现，hsa_circ_0000177阻断WNT信号转导，而miRNA-638抑制或FZD7恢复则促进WNT信号转导，提示hsa_circ_0000177通过上调FZD7的表达促进WNT信号转导，从而促进胶质瘤的黏附。另一项研究显示，circ-ITCH正向调节肿瘤抑制基因ITCH的表达。circ-ITCH通过充当靶向miRNA-214的海绵并阻断WNT/β-catenin信号转导，促进ITCH的表达，从而阻断肿瘤细胞增殖，然而circ-ITCH在胶质瘤组织中的表达下调。这两种circRNA都通过WNT途径调节肿瘤细胞的增殖。

Wang等报道circNT5E在胶质瘤细胞中过表达，circNT5E作为靶向miRNA-422a的海绵，在体内试验中，circNT5E基因的敲除显著抑制了U251细胞的生长、增殖、侵袭和迁移，并促进了细胞凋亡。Xu等发现，circNFIX作为miRNA-34a-5p的分子海绵，通过靶向circNFIX（si-circNFIX）或miRNA-34a-5p模拟物的小干扰RNA转染胶质瘤细胞，从而抑制Notch信号通路下游蛋白he相关家族bHLH转录因子与YRPW基序2（hes related family bHLH transcription factor with YRPW motif 2，HEY2）、Jagged1和hes家族bHLH转录因子1（hes family bHLH transcription factor 1，HES1）的表达。将转染了si-circNFIX的U87细胞注射到小鼠的右侧肢体，与对照组相比，发现肿瘤的大小和体积都缩小了。提取小鼠肿瘤细胞，用定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）和Western blot法检测circ-NFIX、miRNA-34a-5p和神经源性基因Notch同源蛋白1（neurogenic locus notch homolog protein 1，NOTCH1）的表达，结果表明si-circNFIX在体内通过抑制NOTCH1的表达而抑制胶质瘤的生长。

研究表明，circRNA在胶质瘤的发展过程中起到miRNA海绵的作用。例如，hsa_circ_0007534靶向miRNA-761上调了锌指蛋白5（Zic family member 5，ZIC5）基因的表达，从而促进了胶质瘤细胞的增殖和迁移。hsa_circ_0046701靶向miRNA-142-3p调控ITGB8基因的表达。hsa_circ_0012129作为海绵靶向miRNA-661调控胶质瘤细胞增殖。hsa_circ_0008344的缺失可能通过与miRNA-433-3p/miRNA-450b-3p结合来抑制胶质母细胞瘤细胞的迁移和侵袭。circ-CFH作为靶向miRNA-149的海绵调控蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）1信号通路。在许多肿瘤中检测到的circHIPK3能够靶向miRNA-654调控肿瘤基因胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白3（insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 3，IGF2BP3），所有这些circRNA都在胶质瘤组织中上调。

在胶质瘤细胞中，circ-TTBK2与miRNA-217呈负相关，circ-TTBK2表达上调，miRNA-217表达下调。HNF1β基因是miRNA-217的靶点，在多种肿瘤中起癌基因的作用。miRNA-217能够阻止circ-TTBK2介导的胶质瘤细胞进展。

另一项研究发现，CDR1反义RNA（CDR1 antisense RNA，CDR1-AS）在胶质瘤中的表达较正常脑组织下调，且与miRNA-671-5p的表达呈负相关。实验数据表明，CDR1-AS的下调是由于miRNA-671-5p介导的CDR1-AS降解，而CDR1-AS是已知的唯一被miRNA-671-5p降解的circRNA。

综上所述，circRNA和miRNA相互作用参与胶质瘤的形成和发展，并在胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡中发挥重要作用。

2.2 circRNA编码蛋白和RNA结合蛋白与circRNA结合参与胶质瘤的进展

circRNA除miRNA海绵的作用外，还可以编码与疾病进展有关的蛋白质。Yang等发现，circ-FBXW7在胶质瘤中的表达低于正常脑组织。circ-FBXW7由FBXW7基因外显子3和4组成，在circ-FBXW7中有一个潜在的开放阅读框架，能够编码185个氨基酸的蛋白质，这个开放阅读框架是可以翻译的，在内部核糖体插入位点（internal ribosome entry site，IRES）的驱动下翻译成蛋白质。双荧光素酶载体系统表明，circ-FBXW7通过IRES元件的“非帽依赖”实现独立翻译。为了证实circ-FBXW7能够在细胞中翻译，将带有标签的质粒转染293个T细胞中，并对其翻译产物进行鉴定，结果表明带有标签的抗体仅存在于circ-FBXW7-FLAG和FBXW7-FLAG中。在转染细胞中检测到一个约22 kD的蛋白，表明该质粒已被翻译（FBXW7-185aa）。研究人员随后建立了circ-FBXW7和FBXW7-FLAG过表达载体，它们在U251和U373细胞中表达，并导致G期阻滞。当circ-FBXW7被敲除后，FBXW7-185aa的表达降低，细胞周期加快，细胞存活率提高。这些结果表明，FBXW7-185aa能够诱导胶质瘤细胞周期阻滞并抑制胶质瘤细胞增殖。此外，FBXW7-185aa与泛素特异性蛋白酶28（ubiquitin specific peptidase 28，USP28）竞争性地相互作用并释放FBXW7a来降解cmyc，cmyc是肿瘤发生的关键调控因子。在胶质瘤中，circ-SHPRH也能编码蛋白质，在以往的研究中，circ-SHPRH被证明是肝细胞肝癌的生物标志物。Begum等表明，SHPRH作为一种重要的肿瘤抑制因子，circ-SHPRH能够编码新的蛋白SHPRH-146aa，采用液相色谱-质谱联用技术，从circ-SHPRH中直接制备SHPRH-146aa，SHPRH-146aa还可以防止SHPRH降解，从而调节胶质瘤的进展。

另一项研究发现了circSMARCA5能与RBP结合，并在胶质瘤中表达降低，过表达circSMARCA5可以抑制肿瘤细胞的迁移。据预测，circSMARCA5富含RBP结合位点，在过表达circSMARCA5的U87MG细胞中，丝氨酸和富含精氨酸的剪接因子3（serine and arginine rich splicing factor 3，SRSF3）RNA异构体的表达增加，包含外显子4。这个外显子通常被依赖于SRSF1的方式跳过，SRSF1是一种已知的参与细胞迁移的肿瘤蛋白的正调控因子。SRSF3与另外两种剪接因子，多嘧啶束结合蛋白1和2相互作用，正向调节胶质瘤细胞的迁移。

2.3 circRNA参与胶质瘤的血管生成并促进胶质瘤的发展

胶质瘤是一种典型的血管依赖性实体瘤，因此抗血管生成疗法可以有效治疗胶质瘤。circRNA参与了胶质瘤的血管生成，促进了胶质瘤的进展。

有研究发现沉默circRNA（cZNF292）可以抑制胶质瘤细胞的增殖，并指出调控肿瘤血管生成的关键因素包括血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、表皮生长因子和活性转化生长因子-β1的水平。在cZNF292下调的U87MG和U251细胞株中，血管内皮细胞生长因子受体 1/2（vascular endothelial growth factor receptor 1/2，VEGFR1/2）表达和表皮细胞生长因子（epidermal growth factor，EGF）受体表达及VEGFR-1/2磷酸化水平均降低。在cZNF292沉默的U87MG细胞中，细胞周期被阻滞在S/G/M期，并且细胞周期与血管生成密切相关。研究还发现，调控细胞周期进程的WNT/β-catenin信号通路成员包括βcatenin、腺瘤性结肠息肉病蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）、Axin、信号转导及转录激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）、信号转导及转录激活因子5（signal transduction and activator of transcription 5，STAT5），其表达也发生了相应的变化，表明WNT/β-catenin途径下调了cZNF292的表达。因此，这个信号通路调节细胞周期以抑制肿瘤的血管生成。

有研究表明，circ-SHKBP1在胶质瘤血管内皮细胞（glioma vascular endothelial cell，GEC）中显著上调，而下调circ-SHKBP1抑制了GEC的血管生成和血管生成因子1（angiogenic factor 1，AGGF1）的表达。该研究还发现，circ-SHKBP1是miRNA-544a/miRNA-379的功能靶点，而叉头框蛋白1（forkhead box P1，FOXP1）和叉头框蛋白 2（forkhead box P2，FOXP2）分别是miRNA-544a和miRNA-379的靶点。有研究表明，FOXP1可以促进肿瘤进展，调节血管功能。此外，miRNA-544a/miRNA-379抑制circ-SHKBP1介导的胶质瘤内皮细胞的血管生成，FOXP1/FOXP2通过上调AGGF1转录促进GEC血管生成。因此，circ-SHKBP1敲低或miRNA-544a/miRNA-379过表达可抑制胶质瘤的血管生成。

2.4 circRNA作为胶质瘤的治疗靶点

circRNA在人脑胶质瘤中有多种作用，根据其功能特性，circRNA可能被用作治疗的靶点。越来越多的研究表明，敲低某些特定circRNA可以显著抑制细胞增殖、迁移或血管生成。siRNA可以针对某些特定的circRNA进行降解，可能是未来治疗胶质瘤的一种好方法，而作为肿瘤抑制因子的circRNA过表达也可以作为治疗策略的一部分。

circRNA的工程研究也取得了一些新的进展，这使得circRNA在胶质瘤治疗中产生新方法。Wesselhoeft等发明了一种通过构建circRNA载体来表达蛋白质的新方法。由于circRNA与线性RNA相比更加稳定，因此基于circRNA的蛋白质表达可能会提高生产效率。结果表明，外源性circRNA能产生非常优质的蛋白质，且产量稳定，这表明circRNA可能是一种优质的、高效的RNA分子，可用于蛋白质表达。Meganck等构建了基于重组腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）载体的组织特异性circRNA表达载体。结果表明，该载体能在小鼠脑、眼和心脏中高效表达circRNA和翻译的circRNA。根据以上两篇报道，可以在不久的将来设计出基于蛋白表达系统具有特定脑靶向的circRNA来治疗胶质瘤。

此外，circRNA的miRNA海绵功能也可用于胶质瘤的治疗。Liu等报道了一种携带5个miRNA-21结合位点的circRNA，命名为scRNA21，它能显著降低miRNA-21的表达水平，抑制胃癌细胞的增殖。这项工作虽然与胶质瘤无关，但针对特定miRNA的circRNA的设计和合成想法对胶质瘤的治疗是有价值的。miRNA-21和许多其他miRNA在胶质瘤的发展过程中起着重要作用，这带来了启发，scRNA21也可以用来干扰胶质瘤中的某些miRNA。构建AAV的circRNA表达载体是实现这一想法的有力选择。

3 小结与展望

胶质瘤是一种严重威胁人类健康的人脑恶性肿瘤。circRNA在人脑中大量表达，参与大脑发育的生理过程。circRNA参与了胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和细胞周期进程，这对胶质瘤的诊断、预后和治疗具有重要意义。circRNA可作为胶质瘤的生物标志物，因此具有诊断意义。circ-FBXW7和circ-SHPRH也可作为预后指标，帮助评估患者的预后。与siRNA相比，circRNA具有较少的脱靶和不良反应。因此，hsa_circ_0001649、cZNF292、hsa_circ_0046701、circNT5E 和circ-TTBK2等circRNA是更有利的分子治疗靶点。circSMARCA与RBP SRSF1结合，是胶质瘤分子治疗的潜在靶点和胶质母细胞瘤的药物抑制剂。circ-SHKBP1在抗血管生成治疗中也有潜在的应用价值。随机RNA测序技术的应用，已经鉴定出许多重要的肿瘤RNA。值得注意的是，在胶质瘤的进展过程中，大多数circRNA被鉴定为miRNA海绵，这表明其他潜在的机制还需要进一步的探索。基于全球肿瘤负担，还需要进一步的研究来揭示circRNA在胶质瘤发病机制中的潜在分子机制，并提高对所涉及的调控网络的理解。最后，进一步阐明circRNA与胶质瘤发病机制的关系，将促进circRNA在脑胶质瘤诊断和治疗中的临床应用。