腐乳中生物胺的产生及其控制研究进展

杨 熙，颜婷婷，殷丽君，贾 鑫

（中国农业大学 食品科学与营养工程学院，北京 100083）

作为一类传统的发酵豆制品，腐乳质地细腻、口感独特、营养丰富、易于消化吸收，已成为深受人们喜爱和欢迎的调味品和佐餐食品。根据前期发酵过程中接种的微生物不同，可以将腐乳分为霉菌发酵型和细菌发酵型。后期发酵过程中不同汤料的添加形成了风味迥异的腐乳，根据其风味可分为红腐乳、白腐乳、青腐乳等。不同类型的腐乳生产流程大致相似，以毛霉型白腐乳为例（见图1），生产过程包括豆腐、毛坯、盐坯以及添加卤汤后发酵成熟等四个阶段[1]。传统的腐乳生产采用半开放式发酵，生产过程中易被环境中杂菌污染，可能造成潜在的质量问题。此外，腐乳仅依靠食盐及乙醇进行防腐，而未通过加热杀菌等方式延长保质期，这进一步导致腐乳中存在微生物及其次级代谢产物等食品安全隐患。

图1 毛霉型腐乳的生产过程Fig.1 Production process of Mucor-type sufu

生物胺（biogenic amines，BAs）是一类广泛存在于发酵食品中的具有生物活性、含氮的有机碱性低分子质量化合物，主要由微生物分泌的氨基酸脱羧酶催化而形成。适量生物胺对人体有益，但过量的外源生物胺摄入会破坏含量平衡，可能引起机体出现一些不良症状，如引起血压升高、呕吐、出汗及偏头疼[2-3]。有学者建议，食品中的总生物胺含量不得超过900mg/kg，否则会对人体健康产生危害[4]。其中，毒性最大的组胺，在食品中允许的最大含量为50～100mg/kg[5]。然而，研究者们检测发现，市售腐乳中生物胺含量过高的现象，对腐乳的食用产生了健康风险。因此，控制腐乳中生物胺含量已愈发受到学者们的关注，这对提升产品质量及保障消费者健康有重大意义。

1 腐乳中生物胺的产生

1.1 腐乳中生物胺含量

近年来，有关腐乳中生物胺含量的调查检测已有大量相关报道。有研究者检测了红、白、青三种腐乳的生物胺含量，发现有82.61%的白方腐乳样中总生物胺的含量超过了900mg/kg[6]。某些市售腐乳中生物胺含量超过了1000mg/kg，也有的酪胺含量高达700 mg/kg左右，甚至还有个别腐乳中的组胺含量超过了食品中限量标准的3倍之多[7]。有学者研究表示，酪胺一次性摄入量超过100 mg就会引起偏头痛，口服40～100 mg的组胺即能产生恶心、呕吐、头疼等中毒症状[8]。考虑到消费者每天可能的食用量，某些产品已经处于潜在毒性含量范围。因此，甚至存在一种说法，每人每天摄入腐乳最好不超过半块[9]。表1列举了相关学者测定不同腐乳的生物胺种类及含量情况。

表1 不同腐乳中生物胺含量Table 1 Contents of biogenic amines in different sufu

由表1可以看出，腐胺、尸胺、组胺和酪胺是红腐乳和白腐乳中普遍存在的主要生物胺类型，青腐乳中常见的生物胺有腐胺、组胺和酪胺。同一产地的三种腐乳间生物胺含量和种类存在显著性差异，同在北京生产的腐乳，青腐乳中腐胺含量在288～556 mg/kg之间，白腐乳的腐胺含量略低，为96～148 mg/kg，而红腐乳的仅为33～56 mg/kg。这是因为三种腐乳的发酵工艺差别较大，后发酵时灌入的汤汁中添加的辅料作物不同，影响了生物胺的合成量[11]。白腐乳的后酵汤料中通常仅含有食盐和乙醇，而红腐乳中会额外添加红曲和面粉等，青腐乳的辅料还会有其他香辛料。后酵期是腐乳蛋白质水解最关键的时期，大量产生的氨基酸为生物胺合成提供了底物，因此同样也是生物胺快速产生的阶段，生产工艺上的不同导致了三种腐乳在后酵阶段生物胺合成量的差异性。也可以看到，同一类腐乳中生物胺的含量会因为产地导致差异明显。以组胺为例，北京生产的白腐乳中组胺含量高达178 mg/kg，而来自浙江的白腐乳中组胺含量为6 mg/kg。值得注意的是，即便是同一地域的同类腐乳间生物胺含量也有明显不同，如北京生产的两个青腐乳样品之间腐胺、组胺和酪胺含量有显著差异，甚至其中一个样品的酪胺含量高达566 mg/kg，接近另外一个样品的20倍。这些现象与腐乳的加工工艺和环境条件有关。南北方的腐乳在生产流程上并非一致，各企业制作腐乳时的生产环境和卫生条件也难以统一，生物胺的合成很容易受到这些因素的影响，从而使产品之间最终的生物胺含量差异显著。

生物胺的产生很容易受到环境因素的影响，发酵工艺和卫生条件也影响了产品的生物胺含量。另外，不同研究者检测生物胺的方法不尽相同，不同的检测手段也会给最终结果带来一定的误差性。但值得肯定的是，生产工艺和卫生环境对腐乳中生物胺含量和种类有重要影响。严格控制腐乳生产过程中的卫生条件，防止杂菌污染是控制产品生物胺含量的有效措施。

1.2 腐乳中生物胺形成机制

腐乳中生物胺的来源主要有两个：一是生产原料大豆，少量生物胺作为其必需的生物活性成分，起着重要的生理作用[12]。有学者对马来西亚32种不同种类豆腐中生物胺的种类及含量研究发现，色胺、腐胺、组胺等是主要的生物胺种类[13]。YANG B等[7]检测发现，在腐乳白坯阶段，总生物胺含量为30 mg/kg。二是腐乳中微生物分泌的氨基酸脱羧酶作用于氨基酸形成，几种常见生物胺的形成过程如图2所示。发酵前期，大豆蛋白及多肽在发酵菌种及其他杂菌分泌的蛋白酶或肽酶的作用下水解形成水溶性蛋白质；后酵期间进一步水解成氨基酸，而后在对应脱羧酶的作用下脱掉羧基形成生物胺。因此，生物胺的产生有三个前提条件：①分泌氨基酸脱羧酶的微生物；②前体物质氨基酸；③适宜微生物生长和产生氨基酸脱羧酶的环境条件。腐乳中蛋白质水解产生的大量氨基酸以及复杂的微生物结构为生物胺的形成提供了环境。然而，通过减少氨基酸来降低生物胺产生，会影响腐乳品质。因此，抑制氨基酸脱羧酶活性及具有分泌氨基酸脱羧酶能力微生物的生长成为了主要的研究方向。

图2 腐乳中生物胺的形成过程Fig.2 Formation process of biogenic amines in sufu

1.3 氨基酸脱羧酶及其基因

氨基酸脱羧酶（amino acid decarboxylase，AADC）是催化脱去某种氨基酸的氨基生成对应的生物胺或小分子氨基酸的裂解酶总称，其酶活性最高的温度与pH范围分别为20～37 ℃和4.0～5.5[14]，这些酶常见的辅酶因子是5'-磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate，PLP）。AADC的来源主要有植物、动物和微生物等，但微生物分泌的酪氨酸脱羧酶（tyrosine decarboxylase，TDC）活力远高于其他来源的脱羧酶。目前，针对由细菌分泌的组氨酸脱羧酶（histidine decarboxylase，HDC）、酪氨酸脱羧酶（TDC）和赖氨酸脱羧酶（lysine decarboxylase，LDC）研究较多，它们分别由各自的基因hdcA，tdcA和cadA编码，这些脱羧酶基因与参与生物胺形成的其他基因组成了合成生物胺的基因簇。有些脱羧酶可以使具有类似结构的不同物质发生脱羧反应，如肠球菌属、乳杆菌属和葡萄球菌属的TDC，可使苯丙氨酸和酪氨酸脱羧分别产生苯乙胺和酪胺[15]。腐胺可由鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）直接代谢鸟氨酸产生，也可经精氨酸脱羧酶（arginine decarboxylase，ADC）催化精氨酸变成胍丁胺，再由鲱精胺酶催化形成[16]，ODC和ADC分别由speF、speA与adiA基因编码[17]。研究脱羧酶的基因编码，有助于进一步明晰氨基酸的脱羧机理。

1.4 腐乳中与生物胺相关的主要微生物

腐乳中高含量的氨基酸为生物胺产生提供了底物，经过微生物分泌的脱羧酶催化后会合成生物胺。因此，生物胺的产生需要在适宜条件下有前体物质氨基酸，也需要具有产胺能力的微生物的存在。生物胺含量和相应的前体氨基酸水平之间有显著的正相关性，同时也与产胺微生物的数量呈显著正相关[18]。半开放式的发酵条件和漫长的发酵时间给腐乳体系带来了环境中的微生物，腐乳中微生物受种类、地域和生产季节等多因素影响，菌落情况也会随着发酵时间延长而产生变化，其中有些菌种与生物胺的产生有着密切的联系。

1.4.1 腐乳中的真菌

腐乳发酵过程中，除发酵菌种外，还会有其他真菌存在。有研究者从天然发酵的腐乳中分离出了链格孢属（Alternaria）、放射毛霉属（Actinomucor）和酵母属（Saccharomyces）等真菌[19]。有研究者发现腐乳发酵中主要的真菌是曲霉属（Aspergillus）、红曲霉属（Monascus）[20]。

然而，关于腐乳中真菌与生物胺的研究鲜有报道，但作为发酵剂的霉菌，其产胺能力不可忽视。有研究者研究了豆豉的发酵菌种总状毛霉和米曲霉的产胺能力，结果表明米曲霉有ODC基因，总状毛霉含有ODC和TDC基因[21]。

1.4.2 腐乳中的细菌

细菌在腐乳的发酵过程中也同样不可忽视。HUANG X N等[22]发现，肠杆菌属、乳球菌属（Lactococcus）和不动杆菌属是红腐乳发酵过程中最主要的菌属；张雅婷等[23]研究发现，红腐乳中优势细菌菌种主要有枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和粪肠球菌（Enterococcus faecalis）；廖新浴等[24]研究发现，红腐乳主要的优势菌种是蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus），从白腐乳中主要分离出粪肠球菌、吉氏库特菌（Kurthia gibsonii）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）和类肠膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides），青腐乳存在的优势菌种是蜡状芽孢杆菌、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）和粪肠球菌（Enterococcus faecalis）。

关于腐乳中具有产胺能力的细菌，有学者提出，对于生物胺（尸胺除外）的产生而言，细菌比真菌的作用强[20]。腐乳中具有产胺能力的菌株多在后期发酵中分离得到，高含量的氨基酸为生物胺产生提供了前体物质，也可以上调AADC的表达，再加之封闭的发酵环境和体系中相对稳定的温度水平和酸碱环境，细菌分泌的脱羧酶在适宜条件下作用于氨基酸，合成大量生物胺。目前，腐乳中分离出许多产胺细菌，包括肠杆菌属、肠球菌属、芽孢杆菌属和假单胞菌属等。其中，组氨酸能被芽孢杆菌属、库尔提亚属和肠球菌属所利用以产生组胺，芽孢杆菌属和链球菌属是主要的酪胺合成细菌，细菌中编码ADC、ODC、TDC和HDC的基因是主要的氨基酸脱羧酶基因[25]。KUNG F H等[26]将从腐乳中分离出来的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）接种在添加了1.0%L-组氨酸的胰蛋白酶大豆肉汤中培养，结果表明其可产生13.3 mg/L的组胺；HUANG X N等[22]从红腐乳中分离出与组胺和尸胺产生密切相关的假单胞菌属（Pseudomonas）；梁静静等[27]从市售腐乳中筛选出的产胺菌株均为芽孢杆菌属（Bacillus），在培养基上培养后，组胺、腐胺、酪胺和组胺的生成量在1.65～40.27 mg/kg之间；LIANG J J等[20]研究发现，腐乳中的组胺含量与库尔提亚属（Kurthia）的菌落数呈正相关。

2 腐乳中生物胺控制方法

2.1 前发酵期减少杂菌污染

腐乳生产中很容易引入周围环境中的微生物，尤其在毛坯和盐坯阶段，腐乳中微生物总数可达7～9 lg（CFU/g）[28]。此过程被有产胺能力的杂菌污染，氨基酸脱羧酶便迅速大量产生，合成生物胺。因此，严格控制生产车间的卫生状况对控制腐乳的生物胺水平至关重要。FAN X J等[29]在盐坯阶段采用微波方式杀菌和降低盐含量以加快腐乳的发酵速度来制作克东腐乳，微波减少了杂菌污染，最终检测发现总生物胺含量比对照组的减少了46%，同时，实验组腐乳中氨基酸含量和风味物质与正常腐乳的无显著差异。

2.2 后发酵阶段调整汤汁组份

2.2.1 添加抗菌剂

发酵食品中的生物胺含量主要与相关具有分泌氨基酸脱羧酶能力的微生物有关。因此，选择合适的抗菌剂以减少生物胺合成已成为学者的研究重点[30]。食品防腐剂、食品添加剂和天然抗菌物质都具有一定的抑菌性，可抑制微生物生长繁殖，对调控生物胺具有一定的积极作用。有学者指出辣椒及大蒜提取物可显著降低产品中组胺的含量，其原因是抑制了假单胞菌和乳酸菌（产胺菌）的生长繁殖[31]；LU S L等[32]指出，植物提取物（0.19%茶多酚、0.024%生姜、0.025%茴香、0.040%丁香和0.025%肉桂精油）可以抑制产胺菌的生长；LI D W等[33]评价胡椒、姜粉和茴香在腐乳发酵过程中的抑胺作用，发现这三种香料对组胺、酪胺和总生物胺均有显着抑制作用（P＜0.05），尤其添加量2%的生姜粉对组胺、酪胺和总胺的抑制作用最好，总生物胺的抑制率达13.91%，但是对于腐乳的品质影响还需进一步研究。马艳莉等[34]用乳酸菌豆坯代替传统卤水豆坯生产低盐腐乳，可抑制部分杂菌生长，检测到生物胺总量略低于对照组，同时腐乳中游离氨基酸总量为59.85 mg/g，且谷氨酸含量明显增加。此外，红腐乳中的红曲或红曲米也可作为抗菌剂而抑制杂菌的生长，研究发现在白腐乳（7 lg（CFU/g））和青腐乳（5 lg（CFU/g））中的乳酸菌含量高于红腐乳中（2 lg（CFU/g））[23]。

2.2.2 添加NaCl和乙醇

NaCl和乙醇是腐乳后酵汤料中的两种重要组份，同时也是影响生物胺的形成因素。在腐乳成熟过程中，毛霉菌丝主要生长在豆坯的表面，分泌的蛋白酶水解大量蛋白质为氨基酸为生物胺的产生提供前体物质[35]。因为NaCl的作用，蛋白酶可以渗透进腐乳内部降解底物产生氨基酸，氨基酸再通过脱羧酶的催化形成生物胺。然而，高含量的NaCl会抑制产胺微生物的生长和脱羧酶的活力，导致生物胺含量下降。添加乙醇可能会改变细胞膜的理化特性，导致脱羧酶活性降低并减慢转运速率，并最终抑制生物胺的积累[38]。

QIU S等[10]研究发现，8%含量的NaCl能显著降低腐乳中生物胺含量，将含10%～20%乙醇的调味料混合物加入到腐乳样品中，尸胺、酪胺、组胺和苯乙胺的水平也明显低于对照组，成熟腐乳的氨基酸态氮含量稍有降低。YANG B等[36]在腐乳汤汁中添加了含量为8%、10%和12%的NaCl，检测发现成熟阶段腐乳中总生物胺含量显著减少，添加量16%的乙醇对腐胺，尸胺和组胺含量有显著降低作用。同时，实验组的腐乳在发酵过程中所有理化指标均达到标准限值。有学者发现，接种枯草芽孢杆菌的腐乳，经过8%含量的NaCl处理和10%含量的乙醇处理后，实验组的总生物胺量比对照组分别减少了26.48%和29.53%[37]。这些结果表明，较高含量的NaCl和乙醇可用于降低腐乳中生物胺含量，提高腐乳产品的安全性。

2.2.3 控制发酵温度

传统发酵本身受温度变化的影响较大，研究表明，温度＜5 ℃或＞40 ℃不利于生物胺的产生和积累，而温度20～37 ℃时有利于生物胺的积累[38]。腐乳一般在室温下后发酵成熟，外界环境中的温度条件影响氨基酸脱羧酶活力和产胺菌的生长，严格控制发酵环境的温度参数并保持相对恒定的温度水平，有利于降低生物胺的积累。

2.3 成熟期腐乳的处理

成品生产出厂后，货架期的储藏条件也在很大程度上影响了腐乳中生物胺的含量。有学者研究了贮藏温度对青方腐乳中生物胺的影响，结果显示，随着贮藏时间的延长，25 ℃和35 ℃贮藏的青方腐乳，苯乙胺含量比4 ℃和15 ℃的要高；4 ℃下的腐乳在整个贮藏前中后期，都显示出较低的组胺含量和总胺含量[39]。白腐乳开盖后在4 ℃、15 ℃、25 ℃和35℃条件下储藏，60 d内总胺含量在151.11～835.51 mg/kg范围，总生物胺水平随着储藏温度升高而呈上升趋势，酪胺仅在35 ℃下贮藏至第15天时含量超标[40]。刘振锋[41]将成熟腐乳在不同温度下储藏12个月后，检测发现5 ℃下腐乳的腐胺、色胺、2-苯乙胺和酪胺以及总生物胺含量均显著低于10 ℃、15 ℃和20 ℃下的，此外，5 kGy剂量的γ-辐照处理后白腐乳，也能显著降低生物胺含量。

由于环境中微生物较多，腐乳开盖后容易受到杂菌污染。马艳莉等[42]研究储藏时间对开盖后红腐乳生物胺的影响，发现最高的生物胺含量（876.20 mg/kg）在储藏第15天的样品中检测到，是未经储藏样品中总胺含量的10倍左右。因此，在腐乳后期的存储过程中，应尽可能地保持低温条件，从食用安全角度考虑，腐乳开盖后尽量在15 d之内食用完。

当前应用的生物胺控制方法的优势和不足见表2。近年来，降低腐乳生物胺含量的主要手段主要是从抑制发酵过程中产胺菌的生长和控制氨基酸脱羧酶活力两方面出发，控制储藏期生物胺的积累则是在生物胺已经产生后的“补救”措施。不同的措施都有特有的优势，针对腐乳特殊的发酵体系，添加天然的抑菌剂尽管能够有效降低生物胺含量，但此类物质多带有自身风味，可能在口味上对企业的原有产品有所影响。此外，添加剂对腐乳其它质量问题的影响也需要评价，目前对此方面的针对性研究尚有缺乏，抗菌剂的添加无疑也额外增加了更高的成本。因此，调整腐乳后酵汤汁的NaCl和乙醇含量，可在实现控胺目标的同时，对产品的质量和风味影响更小，同时也在一定程度上控制了产品的生产成本。

表2 不同生物胺控制方法的比较Table 2 Comparison of different biogenic amines control methods

3 总结

生物胺广泛存在于腐乳中，含量过高的现象已经越来越受到人们的关注。腐乳中复杂的微生物系统、高含量的游离氨基酸以及适宜的环境条件，决定了其可能存在高含量的生物胺。减少腐乳发酵过程中的生物胺形成是最根本的控胺措施，同时也是控制手段中研究最广泛的。本文归纳总结了有关控制生物胺含量研究的发展程度，并希望从中找到适用于控制腐乳生物胺含量的方法。主要措施有：提高腐乳生产过程中的卫生管理和控制，尤其在毛坯阶段加强措施减少腐乳在开放的发酵环境的杂菌污染；严格控制发酵温度，避免温度波动过大；必要时在现有的生产配料基础上增加某些天然的抑菌物质。最有效可行的是在后酵汤料中添加适量的NaCl和乙醇，NaCl含量过高影响腐乳品质，含量过低则带来安全问题；乙醇添加量过高会减少氨基酸的形成，过低则导致降胺作用不明显。此外，腐乳在储藏期间应保持低温，并在开盖后15 d内食用完。

今后，控胺方法的开发和探索还要将减少腐乳发酵过程中生物胺的合成作为重点，主要是筛选与生物胺形成有关的微生物并控制其代谢，并控制氨基酸脱羧酶的活力。此外，其他发酵豆制品中也有利用生物胺降解菌控制生物胺的研究，此方法也可应用在腐乳的降胺中。当然，任何一种方法都应将感官评价纳入考量的范围，在控制生物胺的同时，保证腐乳的品质。