初级胆汁酸合成途径参与左心衰竭大鼠肺动脉高压的形成*

董 博， 谭兰兰， 胡骏豪， 牛 欢， 周 骐， 武晓静△

（1深圳大学总医院心血管内科，广东深圳 518055；2重庆医科大学第二附属医院心血管内科，重庆 400010）

心力衰竭（heart failure，HF）主要由心脏左心系统疾病引起，是高血压、冠心病和心脏瓣膜病等多种心血管疾病发展的结局。临床上约60%～70%左心功能不全患者会出现肺动脉高压（pulmonary hypertension，PH），称为心力衰竭相关肺动脉高压（HFPH）［1-2］。已有报道心力衰竭进展过程中伴随代谢过程的改变［3-4］，改善心肌代谢常常能改善心衰患者的临床表现和预后［5］。然而，代谢在心力衰竭相关肺动脉高压形成和发展中的作用尚不清楚。为进一步阐明HF-PH 代谢的变化及调节机制，我们通过复制大鼠主动脉弓缩窄（transverse aortic constriction，TAC）建立HF-PH 模型，探讨了PH 形成过程中血清代谢组的变化及可能的代谢途径。

材 料 和 方 法

1 实验材料

1.1 实验动物 雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（6

周龄）26 只，合格证号为No. 44007200091380，体质量（200±20）g，由重庆医科大学实验动物中心提供并饲喂于重庆医科大学动物实验中心IVC 级动物饲养室，健康情况良好。

1.2 主要仪器和试剂 TripleTOF 5600/6600 质谱仪（SCIEX）；1290 Infinity LC 超高效液相色谱（ultraperformance liquid chromatography，UPLC）仪（Agilent）；5430R 低温高速离心机（Eppendorf）。色谱柱：Water，ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm，2.1 mm×100 mm column，Water，ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm，2.1 mm×100 mm column。乙腈（Merck）；乙酸铵（Sigma）。

2 实验方法

2.1 TAC 模型的制备及分组 6 周龄SD 大鼠20 只行TAC，其中1 只死于术中出血，1 只死于麻醉意外，18 只存活。根据术后不同时间分为0 周、6 周和9 周组（均n=6）；另设假手术（sham）组（n=6），手术过程与手术组相同，但不结扎主动脉弓。TAC 模型的建立［6］：腹腔注射戊巴比妥（60 mg/kg）麻醉后，仰卧位将其固定于37 ℃的加热垫上。行气管插管，潮气量为4～6 mL/200 g，呼吸频率为70 min-1，呼吸比为1∶1。在手术区域消毒备皮，从左胸部剪开皮肤，钝性分离胸大肌和胸小肌，暴露出肋骨。在近左胸骨旁第2～3肋间无菌操作下剪开约1.0 cm 水平切口，钝性分离血管、筋膜，拨开胸腺，暴露主动脉弓。用特殊制备的弯镊在右无名和左颈总动脉之间挑起主动脉弓穿一根2-0丝线后，在主动脉弓旁边放置去掉针尖的弯曲的16G 针头（直径1.6mm），结扎主动脉后迅速取出针头，将胸腺放回胸腔。结扎确认无出血后逐层关胸，缝合皮肤。继续通气10 min 左右，待大鼠恢复自主呼吸后，拔出气管插管，放回动物房饲养。术后使用大鼠尾部测量仪测量大鼠心率和血压。

2.2 超声心动图检测 采用VisualSonics 的VeVo 2100 型高分辨小动物超声仪，由超声科具有小动物超声操作经验的医师检测。将各组检测大鼠用2%戊巴比妥腹腔注射麻醉后，其四肢固定于泡沫板上，脱去胸前毛发充分暴露胸骨和左胸廓位置，然后行M 型超声心动图检测舒张期室间隔厚度（interventricular septum thickness at diastole，IVSTd）、收缩期室间隔厚度（interventricular septum thickness at systole，IVSTs）、左室舒张末期内径（left ventricular internal diameter at diastole，LVIDd）、左室收缩末期内径（left ventricular internal diameter at systole，LVIDs）、左室舒张后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness at diastole，LVPWd）、左室收缩后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness at systole，LVPWs）、左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）、左室心肌质量（left ventricular mass，LV mass）和左室舒张末期容积（left ventricular end-diastolic volume，LVEDV）等指标。

2.3 血流动力学的检测 大鼠经2%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后仰卧固定于操作台上，暴露右颈外静脉，结扎远心端，于近心端作一斜切口，用充盈肝素盐水的硬膜外麻醉管于结扎点近心端，顺血管走向插入1 mL 注射器针头，沿针头切口送入右心导管后，将测压管与压力换能器连接，从颈外静脉缓缓送入至上腔静脉、右心房，连接压力换能器与三通管，依据计算机屏幕显示的图像和波幅变化，判断导管尖端位置，根据稳定后的压力波形，测定右心室收缩压（right ventricular systolic pressure，RVSP）；导管再继续往前至肺动脉检测平均肺动脉压（mean pulmonary arterial pressure，mPAP）。

2.4 非靶代谢组学检测 样本采集：用采血针从腹主动脉采集5 mL 血液于肝素抗凝管中，室温静置30 min 后，2 000 r/min 离心10 min 分离血清血浆，取上清，液氮速冻，-80 ℃保存备用。

样本预处理：分别取各组样本100 μL，加入400 μL 预冷的甲醇乙腈溶液（体积比1∶1），涡旋60 s，于-20 ℃放置1 h 沉淀蛋白，14 000×g、4 ℃离心20 min，取上清冷冻干燥。

色谱条件：样品采用Agilent 1290 Infinity LC UPLC 系统的HILIC 色谱柱进行分离；柱温25 ℃；流速0.3 mL/min；流动相组成A 为水+25 mmol/L 乙酸铵+25 mmol/L 氨水，B 为乙腈。梯度洗脱程序如下：0～0.5 min，95% B；0.5～7 min，B 从95%线性变化至65%；7～8 min，B 从65%线性变化至40%；8～9 min，B 维持在40%；9～9.1 min，B 从40%线性变化至95%；9.1～12 min，B维持在95%。

Q-TOF 质谱条件：分别采用电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）正离子和负离子模式进行检测。样品经UPLC 分离后用Agilent 6550 质谱仪进行质谱分析。ESI 源条件如下：气体温度：250 ℃；干燥气体流量：16 L/min；雾化器压强：20 psig；鞘气体温度：400 ℃；鞘气体流量：12 L/min；毛细管电压：3000 V；喷嘴电压：0 V；Fragment 电压：175 V；mass range：50～1 200 m/z；acquisition rate：4 Hz；cycle time：250 ms。

样本检测完毕后，采用TripleTOF 6600质谱仪对代谢物进行鉴定，采集QC 样品的一级、二级谱图。ESI 源条件如下：Ion Source Gas1（Gas1）：40；Ion Source Gas2（Gas2）：80；Curtain gas（CUR）：30；source temperature： 650 ℃ ； IonSapary Voltage Floating（ISVF）±5 000 V（正负两种模式）；二级质谱采用information-dependent acquisition（IDA）获得，并且采用high sensitivity 模式；declustering potential（DP）：±60 V（正负两种模式）；collision energy：（35±15）eV；IDA 设置如下：exclude isotopes within 4 Da，candidate ions to monitor per cycle：10。

3 统计学处理

Q-TOF数据采集按mass range进行分段，50～300、290～600、590～900和890～1 200，从而扩大二级谱图的采集率，每个方法每段采集4个重复。将采集的原始数据经ProteoWizard 转换成.mzXML 格式，然后采用XCMS 程序进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积。代谢物结构鉴定采用精确质量数匹配（＜25 ppm）和二级谱图匹配的方式，检索实验室自建数据库。

将Q-TOFMS 和UPLC-QTOFMS 获得的数据经Pareto-scaling 预处理后，进行多维统计分析，包括无监督主成分分析（principal component analysis，PCA），有监督偏最小二乘法判别分析（partial leastsquares discrimination analysis，PLS-DA）和正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA）。对于多维统计分析变量权重值（variable important in projection，VIP）＞1 的差异代谢物，进一步采用两独立样本t检验进行筛选（P＜0.05）。最后，利用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库（https：//www. genome. jp/kegg/）对差异代谢物进行代谢通路富集分析，对筛选代谢物进行受试者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析，计算ROC 曲线下面积（area under curve，AUC）以及模型敏感性和特异性。

使用SPSS 19.0 软件进行统计学分析。数据以均数±标准差（mean±SD）表示。组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 左心衰竭相关肺动脉高压模型的建立

与假手术组相比，主动脉弓缩窄0 周鼠尾动脉压、心率、体重、左室大小和功能等参数均无明显差异。与0 周组相比，术后6 周和9 周鼠尾动脉压增高。心脏超声提示，与0 周组相比，术后6 周和9 周LV mass 和LVPW 均增高，6 周时LVEF 与0 周组相比差异无统计学显著性，9 周组LVEF 显著降低（表1）。血流动力学检测提示，与0周组相比，术后6周mPAP增高，但仍在正常范围之内［（19.53±0.97）mmHgvs（15.81±0.78）mmHg，n=6，P＜0.05］，术后9 周mPAP 增高［（30.08±1.07）vs（15.81±0.78）mmHg，n=6，P＜0.01），见图1A。术后6 周和9 周RVSP 均增高，见图1B。结合心脏超声和血流动力学结果，TAC术后6 周已出现左室重构，肺动脉压力开始升高，术后9 周进展为HF-PH，提示TAC 术后6 周到9 周为肺动脉高压形成和发展阶段。

表1 TAC术后左心结构和功能变化Table 1. The structure and function changes of left heart after TAC surgery（Mean±SD.n=6）

Figure 1. Changes of mPAP and RVSP after TAC surgery. Mean±SD.n=6.*P＜0.05vs 0-week group；†P＜0.05vs 6-week group.图1 TAC对平均肺动脉压和右室收缩压的影响

2 代谢模式分析

我们进一步分析了TAC 术后6 周和9 周的代谢分布模式。TAC 术后9 周组和6 周组样本在正负离子模式下TIC 比较结果显示各色谱峰的响应强度和保留时间基本重叠，说明在整个实验过程中仪器误差引起的变异较小；进一步行OPLS-DA 分析代谢物的二维分布模式，在POS 和NEG 模式下，9 周组与6周组相比代谢模式均明显分离，POS 模式下R2 和Q2 分别为0.805 和0.356；NEG 模式下R2 和Q2 分别为0.994 和0.446。结果提示数据拟合、重复性好，模型稳定有效，心衰发展为肺动脉高压过程中代谢模式发生显著变化，见图2。

Figure 2. OPLS-DA analysis of metabolites by a solvent system under positive and negative ion modes. A：score plot under positive ion mode；B：score plot under negative ion mode；C：permutation test under positive ion mode；D：permutation test under negative ion mode。图2 OPLS-DA分析代谢物分布模式

3 差异代谢物

我们进一步分析了TAC 术后9 周组和6 周组的差异代谢物。根据由OPLS-DA模型获得的特征变量VIP 值，筛选出VIP＞1 且P＜0.05 的差异代谢物，我们发现与6周组相比，9周时差异明显的代谢物有16个（表2 及图3），涉及类固醇及衍生物（cholic acid 和chenodeoxycholate）、胺类（triethanolamine）、有机酸（urea 和L-pyroglutamic acid）和脂肪酸（L-palmitoylcarnitine）等。

Figure 3. The clustering results of hierarchical cluster analysis based on the significantly different metabolites between 6-week（6w）and 9-week（9w）groups after TAC surgery under positive and negative models.图3 TAC术后6周和9周组差异代谢物的聚类分析

表2 TAC术后9周和6周组相比差异代谢物Table 2. Identified significantly different metabolites between 9-week and 6-week groups

我们分析了9 周与6 周组相比代谢通路的变化，发现可能参与肺动脉高压形成的代谢通路有aminoacyl-tRNA biosynthesis、ABC transporters、arginine biosynthesis、valine，leucine and isoleucine biosynthesis、pantothenate and CoA biosynthesis、phenylalanine，tyrosine and tryptophan biosynthesis、mTOR signaling pathway、vitamin digestion and absorption、valine，leucine and isoleucine degradation 和primary bile acid biosynthesis，其中与初级胆汁酸合成相关的代谢物有胆酸和鹅脱氧胆酸，见表3。

表3 KEGG富集代谢通路Table 3. KEGG enrichment pathway analysis

5 ROC曲线分析

我们进一步分析了初级胆汁酸合成代谢通路相关代谢物胆酸和鹅脱氧胆酸预测HF-PH 的价值，ROC 分析两者预测肺动脉高压的AUC 分别为和0.929和0.905，见图4。

Figure 4. ROC analysis of cholic acid and chenodeoxycholate in predicting PH-HF. A：ROC for cholic acid；B：ROC for chenodeoxycholate.图4 ROC分析初级胆汁酸合成通路代谢物预测心力衰竭并发肺动脉高压的价值

讨论

肺动脉高压是左心衰竭的常见并发症，心力衰竭常伴能量代谢改变，本研究中我们通过TAC 建立左心衰竭相关肺动脉高压模型，通过非靶代谢组学等方法研究了心力衰竭发展过程中与肺血流动力学和肺动脉高压形成相关的代谢物和代谢通路。我们发现TAC 术后6 周mPAP 开始升高，9 周时出现HFPH，在PH 形成和发展过程中，代谢模式和代谢物发生显著改变，胆汁酸合成可能参与了HF-PH 形成和发展的过程。

根据WHO 分类，肺动脉高压分为五大类，其中由左心疾病引起的肺动脉高压属于第二大类。左心疾病中，心力衰竭是引起肺动脉高压最常见的病因［1-2］。与特发性肺动脉高压不同，通常认为血流动力学异常是左心疾病导致HF-PH 的重要初始因素。左心功能衰竭时左室和左房负荷增高，增高的左心负荷逆向传递使肺静脉压升高、肺泡毛细血管床屏障破坏，肺血管内压力持续升高会引起肺小动脉收缩及肺血管重构，形成肺动脉高压［7］。本研究中我们通过TAC 建立左心压力超负荷模型，发现TAC 术后6 周LV mass 和LVPW 均增高，mPAP 开始升高但仍在正常范围；9 周时LVEF 降低，mPAP 显著升高，形成HF-PH，提示6～9 周是HF-PH 形成和发展的过程。

虽然HF-PH 由心力衰竭引起，但基于心脏重构的治疗和血管活性药物的应用并不能完全有效改善肺血流动力学［8］。目前对心力衰竭引起肺血管重构的机制尚缺乏深入研究。由于心力衰竭而常伴能量代谢改变，本研究中我们分析了肺动脉高压形成过程中血清代谢组学变化，发现TAC 术后9周与6周相比，血清代谢模式发生显著改变，根据VIP＞1 且P＜0.05 的标准筛选出16 个差异代谢物，涉及类固醇及衍生物、胺类、有机酸、脂肪酸等。进一步KEGG 分析提示多条代谢相关通路发生变化，胆汁酸合成是变化显著的代谢通路之一，与胆汁酸合成途径相关的代谢物有胆酸和鹅脱氧胆酸。

胆汁酸在体内最重要的生理功能是帮助脂类物质的消化和吸收，可分为初级胆汁酸和次级胆汁酸。初级胆汁酸通常以胆固醇为主要原料在肝细胞合成，主要包括胆酸和鹅去氧胆酸，是胆汁酸合成途径的直接产物。初级胆汁酸在肠道细菌作用下第7 位α羟基脱氧转化为次级胆汁酸，包括脱氧胆酸和石胆酸等。合成胆汁酸是胆固醇在人体内的主要代谢方式，约99%胆固醇随胆汁经肠道排出体外。然而，随着对胆汁酸作用的深入认识，近年发现其不仅参与脂代谢，还是属于信号分子，参与消化以外多种生理、病理功能的调节［9］。Zhao等［10］分析了8例特发性肺动脉高压（IPAH）患者的肺组织标本，非靶代谢组研究发现与对照组正常肺组织相比，IPAH 患者肺组织多种胆汁酸代谢物增高，包括牛磺胆酸、甘氨胆酸、牛磺鹅胆酸盐等，进一步基因芯片和RNA 及蛋白水平研究发现肺组织细胞色素P450B1（CYP7B1）高表达，他们的研究提示除肝组织外，肺组织可能也具有从头合成胆汁酸的作用，而胆汁酸代谢可能参与了IPAH的发展。

胆汁酸是核受体法尼酯衍生物X 受体（famesoid X receptor，FXR）的天然配体。而FXR 通常在肝、肾和胃肠道等器官高表达，在非经典胆汁酸靶组织如肺和血管中亦有表达，在人呼吸道上皮细胞、肺血管内皮细胞及平滑肌细胞中均能检测到FXR。胆汁酸和FXR 结合后可直接参与多种基因调控，包括编码调控脂质、葡萄糖、能量代谢稳态以及炎症和纤维化等蛋白质的基因。FXR 活化能够抑制炎症反应并促进肺损伤后的肺修复［11］。Vignozzi 等［12］和Comeglio等［13］通过野百合碱诱导大鼠肺动脉高压模型，发现FXR 受体激动剂奥贝胆酸治疗能显著改善肺动脉高压大鼠的运动耐量和肺血管重构，提示胆汁酸代谢的心肺保护作用。本研究中我们通过TAC 建立左心压力超负荷大鼠心衰模型，发现胆汁酸代谢可能还参与了HF-PH 的发展，与6 周组相比，TAC 术后9 周时血清胆酸增加4.16 倍，鹅脱氧胆酸增加3.67 倍；同时，ROC 分析提示胆酸和鹅脱氧胆酸预测心力衰竭并发肺动脉高压的AUC 分别为0.929 和0.905。结合胆汁酸激活FXR受体通路发挥抗炎和抗纤维化的作用，我们的研究提示胆汁酸代谢在HF-PH 中可能也发挥保护作用，血清胆酸和鹅脱氧胆酸可能成为预测心衰并发肺动脉高压的血清标志物。

胆汁酸的代谢需在肠道微生物的作用下完成，因此胆汁酸与肠道微生物之间存在动态的相互作用。而肠道菌群和肠道微生物在心血管疾病中的作用逐渐引起关注［14］，近年认为肺动脉高压是个系统性疾病，多项研究表明肺动脉高压时肠道微生物的分类和功能均发生改变［15-16］。胆汁酸通过与肠道微生物群和FXR 受体的相互作用参与调节机体代谢、免疫、炎症以及纤维化等过程，我们的结果提示肠道菌群可能也参与了HF-PH 的形成和发展，以胆汁酸受体及肠道微生物为靶点的治疗，可能为临床上HFPH的干预提供新方法。

综上所述，代谢组学通过检测靶向代谢物，通常能为疾病的发生机制、疾病严重程度、疾病进展和潜在治疗方法提供新线索。本研究中我们发现初级胆汁酸合成途径可能参与了HF-PH的形成，可能成为预测早期肺动脉高压的标志物。本研究主要来源于动物实验，存在一定局限性，初级胆汁酸合成途径与临床病例的相关性和临床意义尚待进一步验证。我们的研究为HF-PH的早期识别和治疗提供新思路。