胰岛素样生长因子1促进毛囊间充质干细胞增殖的机制研究

夏颖 丁娟 张建青 陈宏

由于创伤、烧伤和慢性疾病等引起的皮肤缺损，每年有近千万的患者需要移植皮肤替代物进行创口的修复[1]。毛囊间充质干细胞（hair follicle mesenchymal stem cells，HF-MSCs）来源广泛，获取方便，有较强的多向分化潜能和体外扩增能力，是较理想的干细胞来源[2]。如何高效扩增具有自我更新能力和多向分化潜能的MSCs，成为干细胞再生医学研究和应用的基础和关键[3]。

胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）是一种多功能的细胞生长因子，用过表达IGF-1 的成纤维细胞干预动物皮肤创口，可加快创口愈合速度[4]。IGF-1 也能通过活化PI3K/Akt 通路来促进骨髓来源的MSCs 增殖并抑制其凋亡[5]。但IGF-1 处理对HF-MSCs 的作用并不明确。本次研究旨在探讨IGF-1 对离体培养的HF-MSCs 增殖能力的影响，并探讨其可能机制。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 HF-MSCs 分离与培养 2019 年1 月至2020 年12 月期间，选择1 周龄左右的健康雄性SD 大鼠，大鼠由浙江省医学科学院提供，经腹腔注射10%戊巴比妥钠处死，使用75%乙醇浸泡消毒。在体视显微镜下，用眼科剪分离出触须并剪下触须部皮肤，采用0.9%氯化钠注射液漂洗干净；将毛囊组织置于1% Ⅳ型胶原酶和5 g/L中性蛋白酶混合液中，37 ℃消化30 min。取出消化后的毛囊组织在显微镜下分离出毛囊隆突，将毛囊隆突置于上述消化液中消化30 min；随后加入含有10%胎牛血清的KSFM 培养基（由美国Gibco 公司生产）终止消化。将培养液转移至细胞培养皿中，2～3 d 换液1 次，观察细胞生长情况。当细胞达到80%～90%汇合后，消化传代。

1.2 流式细胞术检测HF-MSCs 表面抗原 取第4 代HF-MSCs，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，转入15 ml 离心管中，1000 r/min 离心5 min，弃上清液，用1 ml 磷酸盐缓冲液重悬细胞并计数，调整细胞密度为1.0×106/ml 并移入1.5 ml EP 管中。用4%甲醇固定细胞5 min 后，加入5%的牛蛋白血清封闭30 min，再次离心后用磷酸盐缓冲液重悬，加入CD31、CD44、CD73、CD90 和CD105 抗体（由美国Abcam 公司生产），冰上孵育30 min，加入荧光色标记山羊抗兔和抗鼠二抗（由中国江苏碧云天研究所生产）后继续避光孵育30 min，加入磷酸盐缓冲液清洗1 次，离心结束弃上清液，加入500 μl 的磷酸盐缓冲液重悬后上机行流式细胞分析。

1.3 HF-MSCs 成骨和成脂肪诱导实验 收集P4 代对数生长期细胞，以2×104/孔密度接种于24孔板，细胞贴壁24 h 后更换成骨诱导培养基（含0.2 mmol/L抗坏血酸、100 nmol/L 地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠）进行诱导，此后每隔2 d 更换培养基1 次。诱导3 周后观察到细胞聚集并有矿化结节出现时，弃掉诱导培养基，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞，4%多聚甲醛固定10 min 后按照试剂盒说明书行碱性磷酸酶染色，显微镜下观察钙盐沉积情况。此外，使用脂肪诱导培养基（10 μg/ml 胰岛素、1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L 3-异丁基-1 二甲基黄嘌呤、100 mmol/L 吲哚美辛）进行培养，每3天更换培养基1 次。同样诱导3 周后固定，使用油红-O 染液染色30 min，60%异丙醇洗去多余油红-O，显微镜下观察红色脂滴情况。

1.4 MTT 法检测细胞增殖 取生长状态良好的血管平滑肌细胞，以5×103/孔细胞接种于96 孔板，待细胞融合至80%左右时，本次研究IGF-1 浓度参考Zhang 等[6]研究，分为10 nM IGF-1 组（10 nmol/L IGF-1）、25 nM IGF-1 组（25 nmol/L IGF-1）、50 nM IGF-1 组（50 nmol/L IGF-1）和对照组，各组加入不同的干预因素干预24 h、48 h、72 h 和96 h。待检测时每孔加入5 mg/ml MTT 工作液20 μl，置于培养箱中继续培养4 h。然后每孔加入150 μl 二甲基亚砜并将其置于摇床上10 min，用SpectraMax Plus 酶标仪（由美国Molecular devices 公司生产）于570 nm处测定每个孔OD 值，以表示细胞增殖能力，重复3 次，取均值。检测MAPK 通路的作用时，分为IGF-1+10 μM SB203580 组、IGF -1+10 μM U0126 组和IGF-1+10 μM SP600125 组，干预48 h、72 h和96 h后检测细胞OD值。

1.5 IGF-1 处理对HF-MSCs 内IGF-1R 表达的影响 干预后提取10 nM IGF-1 组、25 nM IGF-1 组、50 nM IGF-1 组和对照组的细胞蛋白，使用BCA 法进行蛋白定量，各组取30 μg 等量蛋白进行SDSPAGE 电泳，湿转法90 min 将蛋白转印至0.45 μm孔径的PVDF 上。转膜后TBST 洗膜3 次，5%脱脂牛奶封闭1 h，加入IGF-1R 和p-IGF-1R 抗体（由美国Cell signaling technology 公司生产）4 ℃孵育过夜。随后，常温下TBST 洗膜3 次，加入对应种属的二抗室温孵育1 h。ECL化学发光法显影，凝胶成像仪上拍照。以目的蛋白与相应非磷酸化蛋白的灰度值比表示蛋白相对表达量。

1.6 Western blot 检测MAPK 通路蛋白改变 干预后提取10 nM IGF-1 组、25 nM IGF-1 组、50 nM IGF-1 组和对照组细胞蛋白，使用BCA 法进行蛋白定量，各组取30 μg 等量蛋白进行SDS-PAGE 电泳，湿转法90 min 将蛋白转印至0.45 μm 孔径的PVDF上。转膜后TBST 洗膜3 次，5%脱脂牛奶封闭1 h，加入IGF-1R、p-IGF-1R 抗体、p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK 和β-actin 抗体（由美国Cell signaling technology 公司生产）4 ℃孵育过夜。随后，常温下TBST洗膜3 次，加入对应种属的二抗室温孵育1 h。ECL 化学发光法显影，凝胶成像仪上拍照。以目的蛋白与相应非磷酸化蛋白的灰度值比表示蛋白相对表达量。

1.7 统计学方法 采用GraphPad Prism 8.2 软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（）表示。各组之间比较采用单因素方差分析和SNK 检验；计数资料比较采用χ2检验。设P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HF-MSCs 的鉴定和分化潜能检测见封二图1、2

由封二图1 可见，CD44、CD73、CD90、CD105 间充质干细胞表面标志物表达阳性率分别为99.72%、99.80%、99.41%和96.44%，而CD31呈阴性，表达率仅为0.05%。

图1 流式细胞仪检测HF-MSCs表面标志物

由封二图2 a 可见，加入成脂肪诱导培养基培养3 周后，细胞行油红O染色结果发现，脂滴形成处细胞被染成红色，证实提取HF-MSCs 具有成脂肪分化潜能。

由封二图2 b 可见，加入成骨诱导培养基对培养3 周后，HF-MSCs 行碱性磷酸酶染色结果发现，钙盐沉积结节处被染成蓝紫色，证实HF-MSCs 有成骨分化潜能。

图2 HF-MSCs成脂肪和成骨分化能力检测

2.2 不同浓度不同时间的IGF-1 对HF-MSCs 增殖影响见表1

表1 不同浓度不同时间的IGF-1对HF-MSCs增殖影响

由表1 可见，干预24 h 时，25 nM IGF-1 组和50 nM IGF-1 组细胞OD 值较对照组增加（t分别=5.96、8.46，P均＜0.05）；干预48 h、72 h 和96 h 时，10 nM IGF-1 组、25 nM IGF-1 组和50 nM IGF-1 组细胞OD 值较对照组增加（t分别=5.69、9.23、11.10、7.88、11.50、14.00、11.10、13.60、16.90，P均＜0.05），且呈剂量依赖性（F分别=5.43、6.03、7.94，P均＜0.05）。

2.3 IGF-1处理对HF-MSCs 内IGF-1R表达的影响见图1

由图1 a 可见，IGF-1 干预HF-MSCs 48 h 后，与对照组比较，10 nM IGF-1 组、25 nM IGF-1 组和50 nM IGF-1 组细胞内IGF-1R 磷酸化水平逐渐增加，且呈浓度依赖性。由图1b可见，50 nmol/L IGF-1干预HF-MSCs 后，5 min时细胞内IGF-1R磷酸化水平开始增加，15 min继续增加，30 min开始下降。

图1 IGF-1处理对HF-MSCs内IGF-1R表达的影响

2.4 IGF-1 对HF-MSCs 细胞内MAPK 通路的影响见图2

图2 不同浓度的IGF-1对HF-MSCs细胞内MAPK通路的影响

由图2 可见，与对照组比较，10 nM IGF-1 组的p-p38 磷酸化水平增加；25 nM IGF-1 组和50 nM IGF-1 组的p38 和ERK1/2 磷酸化水平明显提高，而JNK磷酸化水平无改变。

2.5 MAPK 信号通路在IGF-1 促进HF-MSCs 增殖中的作用见表2

表2 不同干预因素对HF-MSCs细胞增殖的影响

由表1 可见，干预48 h 时，IGF-1 组的OD 值高于对照组，IGF-1+SB203580 组和IGF-1+U0126 组的OD 值低于IGF-1 组（t分别=7.05、5.28、6.17，P均＜0.05）。干预72 h 时，IGF-1 组的OD 值高于对照组，IGF-1+SB203580 组和IGF-1+U0126 组的OD值低于IGF-1 组（t分别=10.55、7.91、9.04，P均＜0.05）。干预96 h时，IGF-1 组的OD值高于对照组，IGF-1+SB203580 组和IGF-1+U0126 组的OD 值低于IGF-1 组（t分别=9.83、6.85、7.22，P均＜0.05）。干预48 h、72 h 和96 h 时，与IGF-1 组比较，IGF-1+SP600125 组细胞OD 值比较，差异均无统计学意义（t分别=0.93、1.34、1.05，P均＞0.05）。

3 讨论

HF-MSCs 作为毛囊的独特干细胞，在毛发的再生中具有重要作用，可作为种子细胞成为组织工程学皮肤构建的研究热点[7]。本次研究分离的大鼠HF-MSCs 表达CD44、CD73、CD29、CD90、CD166 和CD105 等间充质干细胞标志物，而不表达内皮细胞标志物CD31。同时，通过油红-O和碱性磷酸酶染色证明其具有向脂肪和骨组织多分化的潜能。为进一步探索影响HF-MSCs增殖的因素提供实验依据。

生长因子可以促进多种细胞（包括干细胞）的增殖，因此了解生长因子能否促进HF-MSCs 增殖意义重大。有研究发现，表皮生长因子[8]和血小板源生长因子[9]等均可以有效地促进HF-MSCs增殖和毛囊再生。IGF-1 也是生长因子的一种，具有促进细胞增殖、分化，调节物质代谢等多种生物活性的多肽分子[10]。IGF-1 可促进人牙周膜干细胞增殖和胶原蛋白合成，加速其向牙周膜成纤维细胞分化[11]。但是其对HF-MSCs是否有促增殖作用并不清楚。

本次研究结果显示，干预24 h 时，25 nM IGF-1组和50 nM IGF-1 组细胞OD 值较对照组增加（P均＜0.05）；干预48 h、72 h和96 h时，10 nM IGF-1 组、25 nM IGF-1 组和50 nM IGF-1 组细胞OD 值较对照组增加，且呈剂量依赖性（P均＜0.05），表明不同浓度IGF-1 有促进HF-MSCs 增殖的作用，且具有剂量依赖性。IGF-1 可以促进HF-MSCs 增殖，但IGF-1 的作用机制在不同的细胞中有种属和细胞特异性。要了解IGF-1 是否通过IGF-1R 途径发挥作用，首先要知道HF-MSCs是否表达IGF-1R。本次研究中Western blot结果显示，HF-MSCs表达IGF-1R，且IGF-1 干预HF-MSCs 后可通过磷酸化激活IGF-1R，提示IGF-1 可作用于HF-MSCs 内IGF-1R继而进行下游信号转导发挥生物学作用。有研究表明IGF-1 过表达可以通过调节Wnt/β-catenin 信号通路来促进小鼠骨髓间充质干细胞的增殖，继而减少心肌梗死面积[12]。在造血干细胞中，IGF-1 可以明显激活蛋白激酶A 促进造血干细胞再生[13]。与其类似，本次研究发现IGF-1 处理的HF-MSCs 内MAPK 通路中的p38 通路和ERK1/2 通路被激活，而对JNK 通路无明显影响。提示MAPK 通路可能在IGF-1 促毛囊干细胞增殖中起作用。为了进一步验证，使用SB203580 和U0126 干预细胞后发现，干预48 h、72 h 和96 h 时，与IGF-1 组比较，IGF-1+SB203580 和IGF-1+U0126 组的细胞OD 值下降（P均＜0.05），而IGF-1+SP600125 组细胞OD 值无变化（P均＞0.05），表明SB203580 和U0126 能够部分逆转IGF-1 对HF-MSCs 的促进作用。初步结果证实，IGF-1 可以磷酸化激活IGF-1R、MAPK（p38 和ERK）通路来促进HF-MSCs 增殖。然而，IGF-1R 下游存在许多增殖相关的信号通路，如PI3K/Akt 和Wnt/β-catenin 等[14]，有待后续进一步探讨IGF-1 促进HF-MSCs 的其他可能机制。此外，本次研究并未探讨IGF-1 促进HF-MSCs 增殖的同时对其分化能力的影响，后续将进一步行细胞和动物实验，分析IGF-1对HF-MSCs分化能力的影响。

综上所述，IGF-1 可通过激活p38 和ERK1/2 通路促进HF-MSCs 增殖，具有调节毛囊干细胞活性的作用。后续将通过动物实验，进一步探讨IGF-1 对大鼠皮肤损伤后毛囊再生的促进作用及其可能机制，为基于开发IGF-1 干预毛囊再生相关疾病提供新的研究思路。