基于TGF-β1、EGF、TNF-α水平研究吉西他滨对膀胱炎模型大鼠灌注的作用

王潘红 郑明 蔡云峰

腺性膀胱炎在临床上是一种特殊且较为少见的膀胱黏膜增生性病变，以前认为其发病率在0.1%～1.9%，但随着医疗技术的发展，膀胱镜的广泛使用，使诊断率有所提高，腺性膀胱炎的发病率有上升的趋势[1]。腺性膀胱炎部分分型有癌变倾向，会逐渐演变发展成为膀胱多种恶性肿瘤[2]。目前，临床上多采用经尿道电切术的干预手段对患者进行治疗，再配合化疗药物进行膀胱灌注。但由于化疗对机体组织有诸多不良反应，给患者及其家庭的生活质量带来了严重不良影响。本次研究旨在研究TGF-β1、EGF、TNF-α 在吉西他滨灌注治疗腺性膀胱炎中的作用，为临床研究提供一定的参考。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验材料 2020 年5 月至2020 年11 月期间，衢州市食品药品检验研究院选择30 只SD 雌性大鼠进行实验，大鼠2～3 月龄，体重220～240 g，采用12 h 恒定昼夜交替光照，相对湿度为50%～70%，温度为22 ℃～26 ℃的饲养条件，自由饮食饮水，适应性饲养1 周后，将30 只大鼠按随机数字表法分为三组：吉西他滨组、模型组、对照组，每组10 只。三组大鼠均自由饲养。

1.2 方法

1.2.1 建立腺性膀胱炎大鼠模型 参照蔡蔚等[3]方法，对吉西他滨组和模型组共计20 只大鼠建立腺性膀胱炎模型。腺性膀胱炎模型建立方法为：20 只大鼠通过采用25%乌拉坦（1 g/kg）腹腔注射麻醉，仰卧位将大鼠固定，常规消毒尿道口及四周。用外导管经尿道后壁插入尿道，将大鼠残余尿液排尽后用注射器注入0.2 ml 的DH5α 大肠杆菌溶液（108～9CFU/100 Ul），每间隔1 d，对两组大鼠进行一次灌注，一共进行20 次。50 d后成功建立腺性膀胱炎大鼠模型。对照组大鼠10 只大鼠采用同样的操作方法，对其膀胱灌注等量的0.9%氯化钠注射液。

1.2.2 灌注给药 吉西他滨组大鼠以1.2.1 的灌注方式对10 只给予吉西他滨（150 mg/kg）灌注，每周对大鼠进行一次灌注，6 周后改为每2 周进行一次，共计8 次。模型组和对照组大鼠采用同样方式，对其膀胱灌注等量0.9%氯化钠注射液。

1.3 检测指标

1.3.1 尿动力学检测 参照李文标等[4]的方法，对三组大鼠进行尿动力学检测。在用乌拉坦麻醉后，仰卧位将大鼠固定，用外导管插入膀胱，通过三通阀使外导管与压力感受器和微量灌注泵连接，将大鼠残余尿液排尽后，向膀胱以0.1 ml/min 缓慢灌注常温0.9%氯化钠注射液。记录三组大鼠最大膀胱测压容积、排尿间隔、膀胱顺应性等数据。

1.3.2 RT-PCR 检测TGF-β1、EGF、TNF-α 基因mRNA 的相对表达量 在完成尿动力学检测后将大鼠处死，收集大鼠膀胱组织。取每只大鼠半个膀胱制成匀浆，用于检测TGF-β1、EGF、TNF-α 基因mRNA 的相对表达量。按RT-PCR 试剂盒从肝脏中提取总RNA，再以此为模板合成cDNA，再进行扩增，进行RT-PCR，通过观察循环数（Ct）值，计算2-ΔΔCt值进行靶基因细胞因子定量分析。引物由通用生物系统（安徽）有限公司合成，引物设计见表1。

表1 目的基因TGF-β1、EGF和TNF-α扩增引物序列

1.3.3 免疫蛋白印迹法检测TGF-β1、EGF、TNF-α蛋白的相对表达量 取余下半个膀胱制成匀浆，采用免疫蛋白印迹法检测膀胱组织匀浆的TGF-β1、EGF、TNF-α水平。膀胱组织匀浆加入适量RIPA裂解液提取总蛋白，并采用二喹啉甲酸法对蛋白进行定量，取30 μg 待测样本蛋白进行Westen blot 检测。具体操作方法如下：在10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，把凝胶转移到聚偏二氟乙烯膜（0.22 μm，转膜电流0.2A）上，加入5%脱脂奶粉封闭2 h 后加入工作浓度1∶1000 的TGF-β1、EGF、TNF-α抗体后在4 ℃冰箱孵育过夜。再用磷酸缓冲盐溶液漂洗3 次后，加入相应的二抗孵育2 h 后，即可在暗室中X 线曝光、显影，利用Quality One 对蛋白条带灰度进度分析，以β-actin 为内参计算样本蛋白相对表达量。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，符合正态分布计量资料以均数±标准差（）表示，方差齐的多组间比较均采用单因素方差分析，两两比较行LSD-t检验。设P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR 检 测TGF-β1、EGF、TNF-α 基 因mRNA的相对表达量的结果见表2

表2 三组大鼠TGF-β1、EGF、TNF-α mRNA的相对表达量比较

由表2 可见，三组大鼠的TGF-β1、EGF、TNF-α基因mRNA 的相对表达量比较，差异均有统计学意义（F分别=22.94、22.59、30.32，P均＜0.05）。吉西他滨组和模型组大鼠的TGF-β1、EGF、TNF-α 基因mRNA 的相对表达量高于对照组，差异均有统计学意义（t分别=2.93、3.34、3.52；6.72、6.71、5.81，P均＜0.05）。与模型组比较，吉西他滨组大鼠的TGF-β1、EGF 基因mRNA 的相对表达量较高，TNF-α 基因mRNA 的相对表达量较低，差异均有统计学意义（t分别=3.64、3.19、2.08，P均＜0.05）。

2.2 免疫蛋白印迹法检测TGF-β1、EGF、TNF-α 蛋白的相对表达量的检测结果见图1和见表3

图1 三组大鼠TGF-β1、EGF、TNF-α蛋白的相对表达量

由表3 可见，三组大鼠的TGF-β1、EGF、TNF-α蛋白的相对表达量比较，差异均有统计学意义（F分别=39.21、67.53、56.69，P均＜0.05）。吉西他滨组和模型组大鼠的TGF-β1、EGF、TNF-α 蛋白的相对表达量高于对照组，差异均有统计学意义（t分别=8.76、5.81、4.65；8.76、11.61、1.70，P均＜0.05）。与模型组比较，吉西他滨组大鼠的TGF-β1、EGF 蛋白的相对表达量较高，TNF-α 蛋白的相对表达量较低，差异均有统计学意义（t分别=2.80、5.80、2.79，P均＜0.05）。

表3 三组大鼠TGF-β1、EGF、TNF-α 蛋白相对表达量比较

2.3 三组大鼠尿动力学检测结果见表4

表4 三组大鼠尿动力学参数比较

由表4 可见，三组大鼠的最大膀胱测压容积、排尿间隔、膀胱顺应性指标比较，差异均有统计学意义（F分别=40.06、50.51、28.13，P均＜0.05）。吉西他滨组和模型组大鼠的最大膀胱测压容积、排尿间隔、膀胱顺应性低于对照组，差异均有统计学意义（t分别=8.34、9.91、7.90；1.76、3.93、3.49，P均＜0.05）。吉西他滨组大鼠的最大膀胱测压容积、排尿间隔、膀胱顺应性高于模型组，差异均有统计学意义（t分别=6.20、5.32、6.32，P均＜0.05）。

3 结论

腺性膀胱炎是一种多发于女性的膀胱黏膜病变，目前有关腺性膀胱炎的具体发病机制尚未明确，但其病因可能与下尿路感染、下尿路梗阻/异常和膀胱息肉等其他因素长期慢性的刺激有关。在刺激因素的影响下移行上皮逐步形成上皮芽、上皮巢穴，最后再发展成为腺性膀胱炎[5]。腺性膀胱炎临床表现有多种分型，但临床症状缺乏特异性。

TNF-α 在临床中常作为炎症标志物用于判断机体组织内的炎症反应，TNF-α 具有广泛的生物活性，能够通过诱导其他的细胞因子，进而使得炎症细胞聚积，引起炎症反应。已有研究表明，TNF-α 在腺性膀胱炎的发生发展中扮演着重要的角色[6]。本次研究通过RT-PCR 和免疫蛋白印迹法的检测，结果显示，与对照组大鼠比较，吉西他滨组与模型组大鼠TNF-α mRNA 及其蛋白均有所升高，这一结果与周黎强等[7]结果吻合，且吉西他滨组大鼠TNF-α mRNA 及其蛋白低于模型组（P均＜0.05）。提示TNF-α参与了腺性膀胱炎的发展过程，并且吉西他滨能够降低腺性膀胱炎大鼠膀胱组织内TNF-α 的表达。TGF-β1 是TGF 家族成员之一，其广泛存在于机体各个组织中，在细胞生长、分化中扮演着重要的角色。TNF-α 作为炎症因子，能够刺激TGF-β1 的分泌，对炎症反应进行调控，具有一定的抗炎作用[8]。申旭霁等[9]研究认为，TGF-β1 可以诱导膀胱上皮细胞向间质细胞的转变，对炎症组织的修复有重要的意义。EGF 对于细胞的增殖、分裂有着重要的作用，能够促进上皮细胞、成纤维细胞等细胞有丝分裂，促进皮肤、肾等组织损伤部分的修复愈合，具有广泛的生物学意义[10]。本次研究结果显示，与对照组大鼠比较，吉西他滨组与模型组大鼠TGF-β1 和EGF mRNA 及其蛋白均有所升高，且吉西他滨组大鼠TGF-β1 和EGF mRNA 及其蛋白高于模型组（P均＜0.05），均提示了TGF-β1 和EGF 参与了腺性膀胱炎的发展[11]，通过对大鼠膀胱灌注吉西他滨能够促进TGF-β1 和EGF 在膀胱组织内的表达。

膀胱炎患者普遍存在下尿路排尿困难的问题，因此可以通过尿动力学检测评估膀胱炎进展过程。本次研究结果显示，与对照组大鼠比较，吉西他滨组和模型组大鼠的最大膀胱测压容积、排尿间隔、膀胱顺应性均有所降低，且吉西他滨组最大膀胱测压容积、排尿间隔、膀胱顺应性均高于模型组大鼠（P均＜0.05）。结果表明随着吉西他滨组大鼠膀胱组织内炎症因子TNF-α 的降低和TGF-β1 和EGF 的升高，其最大膀胱测压容积、排尿间隔、膀胱顺应性均有明显的改善，表明吉西他滨对于腺性膀胱炎有一定的治疗效果。

综上所述，膀胱灌注吉西他滨在一定程度上能够起到治疗大鼠腺性膀胱炎的效果，减少TNF-α 的表达，促进TGF-β1、EGF 的表达。本次研究为腺性膀胱炎的临床研究提供一定的参考，提示了灌注吉西他滨治疗腺性膀胱炎可能是与TGF-β1、EGF 和TNF-α 有关。本次研究也有一定的局限性，实验的样本过少，对结果可能产生一定的偏倚。结论尚需多中心、大样本量研究进一步确定与证实。