血浆热休克蛋白90α水平在弥漫大B细胞淋巴瘤患者中的临床价值

张逸寅，顾康生，张腾腾，李倩倩，汪倩玲，王慧

（1.安徽医科大学第一附属医院 肿瘤内科，安徽 合肥 230022；2.安徽医科大学第一附属医院医学心理科，安徽 合肥 230022）

非霍奇金淋巴瘤是临床上较为常见的恶性肿瘤之一，当前的流行病学数据显示全球范围内其发病率占全部恶性肿瘤的2.8%，死亡率占全部恶性肿瘤的2.6%[1]。在我国该病的发病及死亡率亦逐年升高，其中弥漫大B细胞淋巴瘤系非霍奇金淋巴瘤最常见的病理亚型。针对该病制订个体化的诊疗策略受到了广泛关注。目前临床上，对于弥漫大B细胞淋巴瘤亟需找到可靠的可反映病情和治疗疗效的外周血肿瘤指标。

热休克蛋白（Heat shock protein，HSP）家族组成的一系列由热休克或细胞应激产生的蛋白质，可以预防细胞凋亡或错误构象折叠。根据其分子量，热休克蛋白家族可分为小HSP、HSP 60、HSP 70 和HSP 90。需要特别关注的是，HSP 家族与多种恶性肿瘤相关[2]。在这些HSP 中，HSP 90α 是一种与蛋白折叠、细胞内性状密切相关的分子伴侣，其还能在细胞外空间中调控肿瘤的生物学行为[3,4]。既往的研究显示，HSP 90α 在肺癌[5]、胃癌[6]、骨肿瘤[7]、大肠癌[8]及胰腺癌[9]等恶性肿瘤中均是可靠的可反映病情变化与治疗疗效的外周血标志物。而其在弥漫大B细胞淋巴瘤中的临床价值尚未探明。

本研究通过分析弥漫大B细胞淋巴瘤患者外周血血浆热休克蛋白90α 表达水平，了解其与疾病临床病理特征的关系，进而阐明其在病情监测及近期疗效判断中的价值。

1 材料与方法

1.1 病例资料与治疗随访方案

本研究获得了安徽医科大学生物医学伦理委员会的批准。纳入2018 年3 月至2020 年11 月期间于安徽医科大学第一附属医院肿瘤内科就诊的弥漫大B细胞淋巴瘤患者60 例，收集治疗前后患者的外周血标本。入组标准包括：1、所有患者在参与本研究前均知情同意；2、所有患者均通过组织病理学检查明确为弥漫大B细胞淋巴瘤诊断；3、所有患者系初诊患者；4、所有患者的体力状态和主要脏器功能可以耐受靶向或化学治疗；5、主要的临床病理特征信息相对完整。排除标准包括：1、患者合并急性或未控制的传染性疾病；2、患者合并严重的心脑血管疾病或风湿病；3、患者存在多原发恶性肿瘤或诊断为其他的淋巴瘤病理类型。肿瘤分期按照2014 年版Lugano 分期的标准。收集到的临床病理信息包括性别、年龄、分子分型、临床分期、国际预后指数（International Prognostic Index，IPI）、B 症状、大肿块、乳酸脱氢酶（Lactic Dehydrogenase，LDH）、东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）评分和结外病变情况。

一线治疗（化疗/靶向联合化疗/靶向治疗）按照病患主管医师的建议和病患的知情同意实施。按照2014 年版Lugano 评效标准进行近期疗效评价。共有四种评价结果，包括完全缓解（Complete Remission，CR）、部分缓解（Partial Remission，PR）、稳定（Stable Disease，SD）和进展（Progressive Disease，PD）。CR 和PR 患者合计用来计算客观反应率（Objective Response Rate，ORR），CR、PR 和SD 患者合计用来计算疾病控制率（Disease Control Rate，DCR）。本研究对纳入患者进行随访，随访截止时间为2020 年12 月1 日。

1.2 外周血收集与酶联免疫吸附试验

使用抗凝管收集患者治疗前和治疗后评估疗效时的外周血标本。通过离心沉淀从全血中分离血浆。商品化的酶联免疫吸附试验试剂盒购自山东烟台普罗吉公司，按照试剂盒说明书要求检测外周血浆中HSP 90α的水平。具体操作如下：分别向预先已加入HSP 90α 抗体的96 孔板中加入稀释血浆标本和标准品。将辣根过氧化物酶标记的抗HSP 90α 抗体加入孔中37℃孵育1 小时。同样在37℃的条件下，通过向每孔中添加四甲基联苯胺试剂A 和B 来观察显色反应。通过添加终止试剂来结束反应。用伯腾分光光度计在450纳米处检测光密度。绘制标准曲线并确定HSP90α 在血浆标本中的含量。

1.3 统计学分析

采用SPSS 软件17.0 版和GraphPad 软件6.0版进行统计学分析。采用偏度和峰度系数法判断淋巴瘤患者基线HSP 90α水平是否符合正态分布。使用Mann-Whitney U 检验评估HSP 90α水平与淋巴瘤患者临床病理特征的关系。采用Pearson 相关系数来比较本研究中涉及的外周血标志物的关联性。Wilcoxon 配对秩和检验用来评价治疗前后和一线治疗失败时HSP 90α水平的变化情况。统计量的显著水平定为小于0.05。

2 结果

2.1 弥漫大B细胞淋巴瘤患者血浆HSP 90α情况以及与临床病理特征的关系

本研究共纳入60 例弥漫大B细胞淋巴瘤患者。这些患者的临床信息及病理特征见表1。

表1 弥漫大B细胞淋巴瘤患者不同临床病理特征与HSP90α水平的关系

全部患者血浆HSP 90α水平所在范围为27.11 ng/ml 至300.25 ng/ml，中位数为86.57 ng/ml。既往文献通过受试者工作特征曲线显示，区分不同类型癌症患者与所有对照组人群HSP 90α的最佳诊断截断值为69.19 ng/ml[10]。本研究中有65.00%的弥漫大B细胞淋巴瘤患者血浆HSP90α的水平高于既往最佳诊断截断值。针对患者基线HSP90α水平进行正态性检验，峰度系数和偏度系数分别为0.214 和3.256，提示HSP 90α水平不符合正态分布。在临床病理特征中，弥漫大B细胞淋巴瘤患者血浆HSP 90α的水平与Lugano 分期（P=0.017）（图1a）、IPI 评分（P=0.015）（图1b）、外周血LDH水平（P=0.001）（图1c）、ECOG 评分（P=0.008）（图1d）以及结外病变个数（P=0.005）（图1e）存在统计学关联，而HSP90α水平与性别、年龄、分子分型、有无B 症状和有无大肿块未见统计学关联。

图1 弥漫大B细胞淋巴瘤患者关键临床病理特征与HSP90α水平的统计学关联

2.2 弥漫大B细胞淋巴瘤患者血浆HSP90α 和LDH的相关性

LDH 是弥漫大B细胞淋巴瘤患者IPI 评分的重要组成要素，通过Pearson 相关系数比较HSP90α 与LDH的相关性，结果发现同一患者中两者之间呈显著正相关（Pearson r=0.563，P<0.001）（图2）。图2 弥漫大B细胞淋巴瘤患者血浆HSP90α 和LDH水平的相关性

2.3 HSP90α水平与弥漫大B细胞淋巴瘤患者一线治疗近期疗效的关系

所有纳入的弥漫大B细胞淋巴瘤患者均接受了一线治疗，病患接受的治疗计划见表2。

表2 弥漫大B细胞淋巴瘤患者的一线治疗方案

全部的60 例弥漫大B细胞淋巴瘤患者均评估了接受一线治疗的近期疗效。其中，30 例患者达到CR，16 例患者达到PR，8 例患者PD，6 例患者处于SD。进一步分析，ORR 和DCR 分别是76.67%和86.67%。在获得肿瘤客观缓解的46 例患者中，评估疗效时患者HSP90α水平较基线显著下降（P<0.001）（图3a）。与此同时，在获得肿瘤控制的52 例患者中，评估疗效时患者HSP90α水平同样较基线时显著下降（P=0.001）（图3b）。

截止至随访结束时间，60 例患者中有18 例出现了疾病进展。本研究收集到这18 例弥漫大B细胞淋巴瘤患者初诊时和一线治疗失败时HSP90α水平。值得关注的是，这些患者血浆HSP90α水平在一线治疗失败时较基线显著升高（P=0.014）（图3c）。

图3 弥漫大B细胞淋巴瘤患者血浆HSP90α水平在接受一线治疗前后的变化情况

3 讨论

针对肿瘤标志物的研究始终是恶性肿瘤研究领域中的热点。弥漫大B细胞淋巴瘤通过肿瘤组织内的CD10、Bcl-6 和MUM1 等蛋白的表达进行分子分型，已成为国际上预测患者生存和判断预后的重要标志[11]。通过外周血进行肿瘤标志物检测较利用肿瘤组织具有很多优势。主要包括取材方便，可动态实时监测以及创伤较小。在弥漫大B细胞淋巴瘤领域，外周血LDH水平是目前公认的可靠肿瘤指标，可反映患者的病情和预后。而继续开发弥漫大B细胞淋巴瘤的外周血标志物成为关注热点。HSP 90α 是一种新发现的肿瘤标志物，基础机制研究发现其被分泌至肿瘤细胞外，进而参与对肿瘤进展和转移的调控，同时其在外周血中可被检测到[4]。在国内，HSP 90α 首先被批准作为原发性肝癌的肿瘤标志物进行病情监测和预后判断[12]。在弥漫大B细胞淋巴瘤领域，先前的动物试验发现HSP 90 可与Bcl-6 形成复合体[13]，说明其可能是影响弥漫大B细胞淋巴瘤生物学行为的重要分子靶标。近期的另一项研究发现，外周血浆HSP 90α水平有助于对非霍奇金淋巴瘤患者的预后进行判断[14]。但也有相反的结果，一项针对非霍奇金淋巴瘤的小样本研究发现肿瘤组织内HSP90α 与淋巴瘤恶性程度、肿瘤分期、是否有B 症状、是否累及结外及治疗反应均无显著相关性[15]。值得注意的是，这些针对非霍奇金淋巴瘤患者的研究中病理类型为弥漫大B细胞淋巴瘤的比例未知，以上研究结果是否能反映弥漫大B细胞淋巴瘤的情况未可知。故本研究首次针对弥漫大B细胞淋巴瘤患者外周血浆中HSP 90α的表达进行分析研究，发现HSP 90α水平较既往大样本全人群对照组显著升高[10]，这说明该指标在弥漫大B细胞淋巴瘤中潜在的价值。

IPI 评分是反映弥漫大B细胞淋巴瘤患者疾病特征的重要参考因素，其主要包含年龄、分期、ECOG 评分、结外病变和LDH5 个方面。IPI 评分在3 分以上即为高中危、高危患者。在本项研究中，HSP 90α 与分期、ECOG 评分、结外病变和LDH 均显著相关，分期晚、体力状态差、累及2 个结外器官以上和LDH 异常的患者外周血HSP 90α水平显著升高，这说明HSP 90α 与弥漫大B细胞淋巴瘤患者的疾病严重程度密切相关。然而需要关注的是，本项研究中HSP 90α 与分子分型未见关联。而在肺癌的类似研究中发现血浆HSP 90α水平可预测EGFR 突变，与分子分型相关[16]。这说明虽然淋巴瘤细胞内HSP 90 与鉴定GCB 型的关键因子Bcl-6 可形成复合体，但分泌至外周血浆的HSP 90α 是否与弥漫大B细胞淋巴瘤分子分型相关联仍待商榷，需进一步扩大样本量进行研究。

与此同时，肿瘤标志物的一项重要作用是辅助进行肿瘤诊断。在弥漫大B细胞淋巴瘤方面，由于其通过组织病理学诊断尚需有经验的病理医师才能施行，故期望通过外周血标志物来明确该病诊断显得较为困难。目前外周血中的LDH 升高也只能反映病情和预后。本项研究中虽发现HSP 90α 在弥漫大B细胞淋巴瘤中亦有显著升高，但由于其在其他类型的多种恶性肿瘤[5-10,12,17]均有不同程度的异常增高，特别是在其他血液系统恶性肿瘤[18,19]中也存在异常的表达。故考虑其在恶性肿瘤中表达的特异性不强，尚无特异性诊断弥漫大B细胞淋巴瘤的能力。

而在病情评估和疗效监测方面，HSP 90α 在弥漫大B细胞淋巴瘤中有着一定的临床实践意义。本研究发现该指标与肿瘤负荷相关。在治疗后肿瘤负荷减小时HSP 90α 显著下降，而在治疗失败肿瘤负荷增加时HSP 90α 又显著升高。这是对影像学评估抗肿瘤治疗疗效重要且有力的补充。在前期基础研究中，有报道同样发现HSP 90与肿瘤细胞的增殖相关，使用HSP 90 抑制剂成为潜在抑制肿瘤生长的手段[20]。这就从基础和临床方面证实了HSP 90 与肿瘤负荷的关联。

4 结论

总而言之，弥漫大B细胞淋巴瘤患者血浆HSP 90α水平所在范围为27.11 ng/ml 至300.25 ng/ml，中位数为86.57 ng/ml。这些患者血浆HSP90α的水平与Lugano 分期、IPI 评分、外周血LDH水平、ECOG 评分以及结外病变个数存在统计学关联。同一患者中HSP90α 和LDH水平之间呈显著正相关。在获得肿瘤客观缓解或疾病控制的患者中，评估疗效时HSP 90α水平较基线显著下降。而在一线治疗失败时，患者血浆HSP 90α水平较基线显著升高。HSP 90α 可作为弥漫大B细胞淋巴瘤患者病情监测及近期疗效判断的血浆肿瘤指标。