吉非罗齐纳米脂质体的制备及降脂功效的研究①

张向宇， 付 琳， 高 嵩， 张 杰， 孟祥祎

(佳木斯大学药学院,黑龙江 佳木斯 154007)

0 引 言

吉非罗齐(Gemfibrozil,GEM)是最重要的贝特类药物之一，在高血脂症的治疗中起重要作用。它在人体内溶解度较低，有效吸收量极少、消除半衰期短，所需给药频率较高等因素限制了它的应用。纳米脂质体作为一类新型药物递释系统可以提高溶解度、稳定性、增加制剂缓释效果[1-3]。脂质体(liposomes,LPs)一般是由胆固醇和磷脂构成的球型微囊结构的载体制剂，可以包载多种药物[4-5]。吴敏等采用高压均值法制备辛夷挥发油纳米脂质体，包封率79.4%，其在模拟释放环境中30min内有突释，突释后实现缓慢释放12h累积释放量46.3%[6]。实验采用乙醇注入法制成吉非罗齐纳米脂质体(Gem-Nlps)，改善了吉非罗齐的溶解度，延长体内代谢时间，减少给药次数；恢复血脂水平和体内清除自由基的能力，降低动脉硬化指数和血脂综合指数，减轻氧化损伤。有望成为治疗高血脂症的有效制剂治疗方案无效的重症高血脂症患者治疗替代方案。

1 材料和方法

1.1 实验材料

DF-101S集热式恒温磁力搅拌器(上海力辰仪器科技有限公司)；KQ-2200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；JY92-2D超声细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；Agilent 1100series高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；Zetasizer Nano ZSE纳米粒度电位仪(英国马尔文公司)；Hitachi HT 7700型透射电子显微镜(日本日立公司)；TGL-16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；多功能酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；注射用大豆卵磷脂(上海太伟药业有限公司)；胆固醇(大连美仑生物技术有限公司)；吉非罗齐(大连美仑生物技术有限公司)；甲醇为色谱纯，其他有机试剂为分析纯，水为双蒸水。

雄性SPF级KM小鼠48只，购买于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，合格证编号：201900030423，许可证号码：SCXK(吉)-2018-0007

1.2 Gem-Nlps的制备

称取一定量的磷脂、胆固醇和GEM，将磷脂和胆固醇置于5 mL无水乙醇中超声溶解为脂质溶液。注射器抽一半体积的空白脂质溶液后，向剩余脂质溶液加入GEM超声溶解，另取一注射器将其抽净。然后将上述两个注射器中的溶液缓慢滴入到装有10 mL的PBS缓冲液中，在50 ℃下磁力搅拌器进行搅拌。搅拌至完全除去乙醇，探头超声混悬液即得[7]。

1.3 GEM分析方法的建立

(1)色谱条件及检测波长的选择

色谱柱：Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇：1%冰乙酸(75：25，V/V)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：室温；检测波长：276 nm；进样量：20 μL。取GEM对照品和空白脂质体，用甲醇稀释至适宜浓度，在200～400nm波长范围内进行扫描。

(2)标准曲线的绘制

精密称取10 mgGEM标准品，放置于50 mL容量瓶，加甲醇溶解超声并定容，摇匀。分别配制浓度为5,10,20,40,60,80和100 μg·mL-1的GEM甲醇溶液，采用HPLC以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

(3)精密度及回收率测定

分别精密配制5,40,100 μg·mL-1的GEM溶液，在一日内平行测定5次峰面积，通过浓度计算日内精密度。同一时间测定5 d，计算日间精密度。分别精密量取配置高、中、低三种浓度的GEM溶液，将样品过0.22 μm微孔滤膜后进样，利用峰面积计算回收率。

(4)包封率的测定

采用石油醚萃取法测Gem-Nlps的包封率，精密移取Gem-Nlps溶液0.5 mL，加入等量的石油醚萃取3次，此时溶液明显分层，取下层溶液放入10 mL容量瓶中，加甲醇超声破乳并定容，HPLC进样20 μL计算浓度，计算得W包。取0.5 mL的Gem-Nlps于10 mL容量瓶超声破乳，同法计算W总，按公式(1)计算包封率：

(1)

2 Gem-Nlps的质量评价

2.1 Gem-Nlps理化性质考察

根据最优处方和工艺制备Gem-Nlps。用透射电镜观察脂质体形态；室温下用纳米粒度仪测量Gem-Nlps粒径大小、分布PDI指数和Zeta电位；石油醚萃取法测脂质体包封率；pH测定；离心加速试验和稳定性考察。

2.2 体外释放实验

本实验采用透析袋法模拟Gem-Nlps的体外释放行为。取Gem-Nlps溶液和GEM药物溶液(与脂质体包封的药物等量)各10 mL，平行3组，分别置于处理过的透析袋后扎紧两端，沉浸在装有500 mL介质的烧杯中，温度设定为(37±0.5)℃，将转速设定为100 r/min。分别于0.25,0.5,0.75,1,2,4,8,10,12,18,24,36 h取样，取样后补加等温的释放介质[8-9]。将样品通过微孔滤膜过滤进HPLC测定计算累计释放百分率。

2.3 高血脂模型小鼠降脂作用研究

适应性饲养一周将其随机分为6组，分别为空白组、模型组、阳性组、Gem-Nlps高、中、低浓度组。空白组灌胃生理盐水(0.2 mL/10 g)，其他组均灌胃同等剂量的高脂乳剂。造模成功后开始药物治疗，对空白组和模型组灌胃生理盐水0.2 mL/10g，阳性组灌胃等量辛伐他汀溶液，每日给药一次。Gem-Nlps组小鼠分别灌胃高中低浓度Gem-Nlps，每两天给药一次。

末次给药后禁食不禁水12 h，采用眼球取血法取小鼠血液，处死后剥离取出肝脏、皮下附睾和肾周的脂肪组织，称其湿重。测定小鼠的血液总胆固醇TC，甘油三酯TG，高密度脂蛋白胆固醇HDL-C，低密度脂蛋白胆固醇LDL-C，谷丙转氨酶ALT，谷草转氨酶AST，丙甲醛MDA，总超氧化物歧化酶T-SOD肝脏TG，TC等指标。根据指标按照公式(2)和(3)分别计算动脉硬化指数AI和血脂综合指数LCI。

(2)

(3)

3 结果与讨论

3.1 方法学的建立

(1)检测波长的选择

全波长扫描可知GEM在276 nm和281 nm处有吸收峰，空白脂质体在此处没有干扰。我们选择276 nm为检测波长。

(2)标准曲线的绘制

以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标做GEM标准曲线方程为S=6.5455C+9.3589(r= 0.9997)，在5～100 μg·mL-1范围内线性关系良好，如图1所示。

图1 GEM的标准曲线

(3)日内日间精密度实验

实验结果，三个浓度GEM溶液的日内精密度RSD分别为1.430%，1.863%，1.207%，日间精密度RSD分别为1.777%，1.639%，1.151%，小于2%，符合方法学要求。

(4)回收率实验

实验得到浓度为5,40,100μg·mL-1的GEM溶液回收率分别为98.93%,99.63%和98.70%，回收率高，RSD值分别为1.343%,1.486%,1.154%，均小于2%，符合方法学要求。

3.2 Gem-Nlps的质量考察

Gem-Nlps包封率为(80.73±1.65)%，载药量为(6.48±0.12)%，如表1。透射电镜视野下的Gem-Nlps形状呈类球形，粒径平均，分散均匀，无团聚现象如图2。粒径为(122.82±3.61)nm，粒度分布图呈单峰且无杂峰，PDI为0.181±0.01，分布均匀，如图3所示。Zeta电位为(-23.77±0.60)mV，如图4所示。

图3 Gem-Nlps的粒径及分布

图4 Gem-Nlps的Zeta电位

表1 Gem-Nlps的包封率及载药量(n=3)

图2 Gem-Nlps透射电镜照片(10K)

3.3 Gem-Nlps体外释放

体外释放结果见图5在人工胃液和人工肠液中，Gem在4 h释放超过80%。Gem-Nlps在胃液和肠液中2 h内分别释放19.29%和24.89%，不到40%，无突释效应。且在人工肠液中，Gem-Nlps在18 h时累计释放率已超过80%，24 h时达到90.45%，说明Gem-Nlps达到缓释效果。

图5 Gem和Gem-Nlps的体外累计释放率(n=3)

3.4 高血脂模型小鼠降脂作用研究

(1)小鼠血脂指标检测情况

如图6(a)，模型组相对空白组都具有极显著差异(P<0.01)，其中TG,TC,LDL-C水平显著增高，而HDL-C水平显著降低，提示高脂模型造模成功；通过治疗，各给药组都有治疗效果，其中Gem-Nlps高浓度组效果最佳。

图6(b)可见，模型组的动脉硬化指数AI和血脂综合指数LCI指数增长数倍。通过治疗，阳性组、Gem-Nlps高、中、低浓度组AI和LCI均降低且效果显著。

(2)小鼠血清肝脏酶及抗氧化指标情况

转氨酶ALT和AST指标反映肝脏的损伤程度。由图6(c)可知，模型组ALT和AST活力显著高于空白组(P<0.01)，造模导致小鼠肝损伤。Gem-Nlps高、中浓度组和阳性组对ALT,AST都有显著的降低(P<0.01)。丙二醛(MDA)反映了细胞的受损程度。超氧化物歧化酶(T-SOD)反映机体清除自由基的能力[10]。MDA采用TBA法测定，T-SOD采用羟胺法测定。模型组的MDA相对于空白组明显升高，T-SOD明显降低(P<0.01)，说明小鼠由于高脂乳剂导致体内发生氧化损伤。

(3)小鼠肝组织TC,TG水平情况

图6(d)可知模型组的TC,TG指标异常。治疗后发现，阳性组、Gem-Nlps高浓度组、中浓度组对于肝组织TC,TG均有控制效果，高浓度实验组效果最好。

图6 (a)血清TG,TC,LDL-C,HDL-C水平;(b)AI,LCI值;(c)肝脏酶和抗氧化指标的水平;(d)肝组织TG,TC水平

4 结 论

实验采用乙醇注入法制备Gem-Nlps，包封率在80%以上符合脂质体包封率要求。脂质体溶液外观呈现淡蓝色乳光，电镜下为圆整球形，平均粒径122nm，平均Zeta电位-23mV，呈现较好的稳定性。体外释放结果表明Gem-Nlps有效的延长了药物的作用时间，实现了缓释作用。高血脂模型小鼠体内实验结果表明Gem-Lips可以显著降低TC,TG,LDL-C，升高HDL-C，从而降低了AI和LCI指数，而且Gem-Lips可以降低肝脏ALT和AST酶的活性，缓解高脂乳剂造成的肝脏损伤。在抗氧化指标上。降低MDA水平，提高了T-SOD水平，具有增强机体抗脂质过氧化的效果。