EMS处理对小麦种子萌发和幼苗生长的影响

余徐润，章 蓉，冉莉萍，周露艳，杨逸洲，熊 飞*

(1 江苏省作物遗传生理国家重点实验室培育点/粮食作物现代产业技术协同创新中心/扬州大学教育部农业与农场品安全国际合作联合实验室，扬州大学，江苏扬州 225009；2 扬州大学 广陵学院，江苏扬州 225128)

小麦(TriticumaestivumL.)是一种重要的粮食作物，在世界范围内广泛种植。中国是小麦生产和消费大国，近5年，中国小麦库存量连年增加，增幅达29.9%,显著高于世界小麦库存总量增幅16.7%[1]。小麦产业发展直接关系到中国的粮食安全和社会稳定[2]。种子是农作物生产的基础，使用高质量的种子能为获得较高的产量提供更好保证。小麦种子的萌发率和幼苗生长状况会直接影响产量和品质，在小麦育种和生产过程中，会有许多因素影响到小麦种子的萌发。

甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate, EMS)是一种诱变剂，能诱导碱基烷基化。使用EMS溶液处理种子来构建突变体库是获得优异种质资源的重要途径, 这种方式具有种质突变频率高、遗传变异谱宽、育种周期短等优点[3]。通过突变体的多世代选择和鉴定，可直接或间接地培育出生产上可以利用的作物新品种[4]。赵越[5]通过设立不同浓度梯度的EMS溶液处理小麦后，发现不同小麦品种的根长、芽长具有显著差异，并且高浓度长时间的处理会抑制种子的生长发育甚至死亡。 Arias等[6]用EMS处理燕麦种子后能引起燕麦的产量突变；Natarajan等[7]发现大麦种子在水中预浸16 h或20 h，再用EMS浸泡4 h，可以最大限度地提高种子的敏感性，当使用合适的浓度时，在预浸的这个时间内可以获得最高的突变率；Washington等[8]用EMS处理四倍体小麦的种子，在M1代的叶片中获得了小麦叶绿素性状突变体。此外，还有研究发现不同浓度的EMS处理小麦后，花药愈伤组织的分化率降低；且随着EMS浓度的增加，再生植株的抗旱性提高[9]。适当浓度的EMS处理能够影响小麦农艺性状的数值，例如能够显著降低小麦的株高、主穗长度、穗粒数等[10]。通过不同EMS浓度处理，还可以找到能够使小麦诱变的最佳条件，从而产生具有抗病高产特性的新品种[11-12]。以上研究虽然明确了EMS对麦类作物生长发育有明显影响，然而有关EMS处理对小麦种子萌发和幼苗生长的影响的报道却不多。因此，本研究观测了不同浓度EMS、不同处理时间下小麦的种子萌发情况和幼苗生长的情况，以探明EMS作为一种逆境条件对种子萌发和幼苗生长影响的细胞学机理。

1 材料和方法

1.1 实验材料

本研究以弱筋小麦品种‘扬麦15’为实验材料，种子由江苏省扬州市里下河地区农科所提供。

1.2 EMS处理

将EMS溶于75%的乙醇，再用配制好的pH为7.0的PBS溶液进行稀释，配置成0.0%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%和1.6%的处理液。选取饱满、大小一致的小麦种子用蒸馏水浸泡12 h，浸泡后的小麦种子再用1%的次氯酸钠溶液消毒30 min，然后进行EMS处理。试验共设置以上7个EMS浓度梯度水平，以0.0%为对照(等体积的PBS溶液，pH=7)，每个浓度设置3个处理时长(10 h、12 h和14 h)，共组成21个处理组合，每个处理组合3次重复。将处理好的种子均匀放置在铺好滤纸的培养皿中，每个培养皿40粒小麦种子，置于恒温培养箱中培养；培养条件为白天25 ℃、16 h、光照4 000 lux，晚上16 ℃、8 h、无光照；在每日上午和晚上补加适量蒸馏水确保小麦种子正常生长。

1.3 观测指标及方法

1.3.1 生物量及发芽势和发芽率在开始培养后的3 d、6 d、9 d各取样1次。每组处理随机选择3粒种子，观测根、种子、叶片的数量、长度、鲜重、干重等指标。以种子的胚芽长到约种子一半长度作为种子萌发标准，在种子发芽4 d时计算发芽势，在种子发芽7 d时计算发芽率。

发芽势=第4 天发芽种子数/试验种子数；

发芽率=第7 天发芽种子数/试验种子数。

1.3.2 组织化学染色分别在开始培养后的3 d、6 d、9 d，各组随机取3粒种子，去掉根和叶，保留颖果部分，将种子纵切，室温下使用I2/KI(0.3% I2+1% KI)染色约1 min，使用体视显微镜观察胚乳消耗情况并采集图像。

1.3.3 显微结构观察从每组处理随机选择3粒种子，去除根和叶并保留颖果部分，用2.5%的戊二醛固定。其中对处理6 d的种子根部进行单独取样，选取培养皿外的部分，在靠近根部1/4处用刀片进行分离，并用2.5% 的戊二醛固定。将固定好的样品在震荡机上低速震荡3 h左右后吸去前固定液，加入1～2 mL PBS低速震荡10 min并重复3次。参照余徐润[13]的方法制作树脂样品块。在模具中用树脂浸透样品，使用恒温箱于70 ℃条件下聚合24 h获得样品的包埋块，冷却后即可进行半薄切片。使用Leica ultracut R型超薄切片机进行半薄切片。用刀片修整包埋块，使样品接近包埋块表面且保持切面平整；在超薄切片机上得到1 μm厚度的半薄切片后，用细玻璃管捞出切片置于提前滴加少量水的载玻片上，置于Leica EMMP烘片机上使切片伸展干燥；用1%TBO(甲苯胺蓝)染色并用蒸馏水洗去浮色，再次置于烘片机上烘干；最后在Leica DMLS光学显微镜下观察样本并通过拍摄软件进行图像采集，以便进行后期数据分析。

1.4 数据统计

使用Adobe Photoshop CC 2019对根切片照片的皮层细胞部分染色，使用Image-Pro Plus对染色部分的面积进行测量，获得根部横截面积、维管束横截面积以及皮层面积。数据分析时，每4个数据算一个平均值，作为一个重复。使用SPSS统计分析系统进行方差分析和显著性检验(P< 0.05)。

2 结果与分析

2.1 EMS处理对小麦种子发芽势和发芽率的影响

在相同 EMS处理时间下，小麦种子发芽势和发芽率均随着EMS浓度增高呈现逐渐降低的趋势；相同EMS处理浓度下，种子发芽势和发芽率均随处理时间延长显著降低，分别在0.8%～1.6%和1.0%～1.6% EMS处理浓度时表现得更明显，且浓度越高，降低速度越快、降幅越大(图1)。以上结果表明，EMS的浓度和处理时间均会影响种子发芽势和发芽率，EMS浓度越高，处理时间越长，小麦种子发芽势和发芽率越低。

图1 不同浓度EMS和处理时间下小麦种子的发芽势和发芽率Fig.1 Germination potential and germination rate of wheat seed under different EMS concentrations and treatment time points

2.2 EMS处理对小麦幼苗生长和生物量的影响

表1显示，不同EMS处理组合的种子萌发第6 d，幼苗叶长随着EMS处理浓度的升高和处理时间的延长逐渐减小，小麦幼苗的生长越缓慢。其中，处理时间为10 h时，小麦幼苗根长在相邻EMS处理浓度之间差异不显著，且根长在EMS处理浓度为0.6%～1.0%与对照(0.0%)无显著差异，在EMS处理浓度为1.2%～1.6%时才表现出显著差异；而幼苗叶长在相邻EMS处理浓度之间则表现出显著差异，且各浓度EMS处理均显著低于对照。当EMS处理时间为12和14 h的时候，处理浓度越高，幼苗根和叶生长越慢，且差异显著；幼苗根长在EMS处理浓度高于0.6%时显著低于对照，而幼苗叶长在各浓度EMS处理下均与对照差异显著。同时，不同EMS处理组合的种子萌发第6天时，随着EMS处理浓度的升高和处理时间的延长，小麦幼苗的叶片鲜重表现出降低的趋势，而种子的鲜重则表现出升高的趋势；在处理时间为10 h时，小麦幼苗生物量(叶鲜重和种子鲜重)在各浓度EMS处理下均与对照差异显著，而在处理时间为12和14 h时，幼苗生物量在EMS处理浓度高于0.6%时才与对照差异显著。以上结果说明EMS处理会延缓小麦幼苗的生长。

表1 不同EMS处理组合小麦种子萌发第6天时幼苗根长、叶长及生物量比较

2.3 EMS处理对小麦种子形态的影响

如图2所示，处理时间10 h时，不同EMS浓度处理的小麦种子萌发时胚乳消耗速度不同。随着萌发时间的推移，种子内的胚乳逐渐被消耗，靠近胚的地方消耗更为明显；在同一时间内，随着EMS处理浓度的升高，小麦种子的胚乳消耗速度变慢。其中，在萌发3 d时，0.6% EMS处理的小麦种子已经出现凋亡空腔(白色箭头所指，下同)，而1.0%、1.4% EMS处理的小麦种子并未出现明显的凋亡空腔(图2，A-C)；在萌发6 d时，0.6%、1.0% EMS处理的小麦种子都已有明显的胚乳消耗，并出现凋亡空腔，但1.4% EMS处理的小麦种子仍未有明显的凋亡空腔(图2，D-F)；在萌发9 d时，3个EMS处理浓度的小麦种子都出现凋亡空腔，且0.6% EMS处理组的胚乳已经消耗殆尽，1.4% EMS处理组的胚乳消耗最少(图2，G-I)。同时，在0.6% EMS处理浓度下，小麦种子在萌发3 d时只有靠近腹侧糊粉层的部位出现凋亡空腔，在萌发6 d时胚乳已被消耗过半，在萌发9 d时胚乳被消耗殆尽(图2，A、D、G)；在1.0% EMS处理浓度下，小麦种子在萌发3 d时未见明显凋亡空腔，在萌发6 d时胚乳开始消耗并出现凋亡空腔，萌发9 d时胚乳被消耗一半(图2，B、E、H)；在1.4% EMS处理浓度下，小麦种子在萌发3和6 d胚乳的凋亡空腔不明显，在萌发9 d时胚乳仅被消耗一部分(图2，C、F、I)。

图中白色箭头所指为凋亡空腔，下同图2 处理10 h时不同EMS浓度处理下小麦种子的形态The white arrow in the figure indicates the apoptotic cavity, and the same as followFig.2 Morphology of wheat seeds treated with different EMS concentrations for 10 h

同时，相同EMS浓度下，经过不同时长处理的小麦种子萌发时胚乳消耗速度也不同，且随着EMS处理时间的延长，小麦种子的胚乳消耗速度变慢(图3)。在萌发3 d时，处理10 h的小麦种子已经出现凋亡空腔，而处理12和14 h的小麦种子并未出现明显的凋亡空腔(图3，A-C)。在萌发6 d时，处理10、12和14 h的小麦种子都已有明显的胚乳消耗，并出现凋亡空腔，但凋亡空腔以处理10 h的小麦种子最大，处理14 h的小麦种子最小(图3，C、D、F)。在萌发9 d时，3个处理时间的小麦种子都出现凋亡空腔，但处理10 h小麦种子的胚乳已经消耗殆尽，处理14 h小麦种子的胚乳消耗最少(图3，G-I)。其中，处理组合0.6% EMS/10 h的小麦种子在萌发3 d时在靠近腹侧糊粉层的部位已经出现凋亡空腔，在萌发6 d时胚乳已经被消耗过半，萌发9 d时小麦种子的胚乳被消耗殆尽(图3 ，A、D、G)；处理组合为0.6% EMS/12 h的小麦种子在萌发3 d未见明显的胚乳消耗，6 d时胚乳被消耗一部分，9 d时消耗更多(图3，B、E、H)；处理组合为0.6% EMS/14 h的小麦种子在萌发3 d时的胚乳凋亡空腔不明显， 6 d时候出现较小的凋亡空腔， 9 d时胚乳被消耗一部分(图3，C、F、I)。

图3 0.6% EMS不同时间处理下小麦种子形态观察Fig.3 Morphological observation of wheat seeds treated with 0.6% EMS at different time points

2.4 EMS处理对小麦种子显微结构的影响

不同EMS浓度下小麦种子的显微结构图显示，随着萌发时间的延长，小麦种子中的淀粉体尺寸越来越小，淀粉体的数量也越来越少(图4)。其中，在萌发3 d时，处理组合0.6% EMS/10 h的小麦种子胚乳内大多数是小颗粒的淀粉体，而处理组合1.0% EMS/10 h和1.4% EMS/10 h的小麦种子中淀粉体大多是尺寸较大的淀粉体，且数量多(图4，A、D、G)；在萌发6 d时，0.6% EMS处理的小麦种子淀粉体体积变小，而1.0%和1.4% EMS处理的小麦种子还有明显的大淀粉体的残留(图4，B、E、H)；在萌发9 d时，0.6% EMS处理的小麦种子淀粉体已明显有部分解体，而1.0%和1.4% EMS处理的小麦种子还有较多的淀粉体残留(图4，C、F、I)。从以上结果可以看出，EMS溶液处理浓度越高，小麦种子萌发过程中淀粉体的消亡速度越慢。

图4 处理10 h不同EMS浓度处理下小麦种子的显微结构(SG. 淀粉体)Fig.4 Microstructure of wheat seeds treated with different EMS concentrations for 10 h(SG. Starch granules)

2.5 EMS处理对小麦根长和根部维管束发育的影响

幼苗形态观察结果表明，不同EMS浓度处理10 h后，小麦幼苗根长均随着萌发时间的增加而逐渐增加(图5，A-L)，随着EMS浓度的增加而逐渐减少，且各EMS浓度之间大多差异显著(图5，M-O)。其中，根长在萌发3 d、6 d、9 d时均以0.0% EMS处理最长，1.4% EMS处理最短。可见，EMS能够影响小麦的生长发育，EMS浓度越高，幼苗根长越短。

图5 处理10 h不同EMS浓度处理下小麦种子根长对比Fig.5 Comparison of root length of wheat seeds treated with different EMS concentrations for 10 h

同时，各浓度EMS(0.0%、0.6%、1.0%和1.4%)处理10 h的小麦种子萌发6 d时幼苗根部显微结构观察结果显示，根部维管束在0.0% EMS处理下较大(图6，A)，但随着EMS浓度的增加而越来越小(图6，B、C)，并在1.4% EMS处理条件下最小(图6，D)。可见，EMS的浓度能够影响小麦幼苗根部维管束的发育进而影响小麦的生长，且EMS浓度越高，小麦维管束越小。另外，对小麦根部的横截面进行染色，用软件计算出不同部位的横截面积，得到不同部位的横截面积对比图(图6，E)。其中，小麦幼苗根部横截面积也在0.0% EMS处理时最大，后随着EMS浓度的增加而逐渐变小，并在1.4% EMS处理时最小；小麦幼苗根部维管束横截面积与皮层横截面积也在0.0% EMS处理下最大，后随着EMS浓度的增加都逐渐减小；幼苗根部横截面积、维管束横截面积和皮层横截面在EMS处理下的降幅均达到显著水平。以上结果说明EMS能够影响小麦维管束与皮层的增长，且EMS的浓度越高，小麦维管束与小麦皮层生长得越慢。

3 讨 论

3.1 小麦种子胚乳消亡和幼苗生物量对EMS的响应

小麦作为中国重要的粮食作物，其生长发育状况是影响产量的重要因素。种子的萌发和幼苗的生长是包括一系列生理生化反应的复杂又漫长的过程。本研究通过不同的EMS处理浓度和处理时间来探究小麦种子萌发的状况。结果表明随着EMS浓度的升高和处理时间的增加，小麦的发芽率和发芽势逐渐降低，幼苗根、叶、种子的生物量明显改变，种子萌发过程中胚乳消亡和淀粉体降解速度变慢，根系发育受到明显抑制，总体呈现为小麦种子的萌发和幼苗的生长在高浓度EMS处理下受到明显抑制。种子的胚乳是贮藏营养的地方，萌发开始时，小麦胚乳的消亡都是从近胚端开始，此后沿着腹沟向远胚端延[14]。本研究在对小麦种子染色后可以在体视显微镜下观察到，小麦胚乳的消亡也从近胚端开始，并且EMS显著抑制了小麦胚乳的消亡速度。另外，小麦根系是吸收水分和无机盐的重要器官，并通过根部内的维管组织进行营养物质传输。本研究表明，经EMS处理后小麦根部维管束面积和皮层面积均减少，根系变细，导致小麦吸收的营养物质减少，从而使其各项生物量发生显著变化。熊君等评价了经EMS诱变的小麦种子产生的M4突变株系群体的农艺性状，结果表明突变株系间在株高、穗长、总小穗数、总分蘖数、有效分蘖数、穗粒数、单株产量等性状上差异极显著[15]，也验证了EMS能够显著改变小麦生物量这一结论。

最新研究表明镉、锌、铜和铅等重金属处理都会影响种子幼苗生长、生理生化过程和根的细胞壁成分[16-19]，且在高浓度下会抑制幼苗的生长。亚硒酸钠[20]、NaCl[21-22]、Na2SO3和NaHSO3[23]等盐溶液在高浓度下会加剧盐胁迫的作用而降低种子发芽率。60Co-γ[24]、5-azaC[25]、PEG[26]等对小麦的生长以及鲜重干重也都有明显的抑制作用。可见，EMS同其他高浓度重金属、干旱、高盐等逆境条件一样，改变了实验材料生长的生存环境，明显影响糖、蛋白质、脂质的消耗以及抗氧化酶活性等，使得实验材料的生理和代谢功能会受到阻碍从而影响种子的萌发和生长[27]。

3.2 不同EMS浓度和处理时间的差异

EMS是一种诱变剂，能够改变植物生存环境并形成一种逆境条件，从而影响植物的生长发育。而不同浓度和不同时间对EMS处理效果也有影响。一方面，高浓度的EMS和较长的处理时间会影响小麦的生长发育。在本研究设置的7个EMS浓度处理梯度和3个处理时间下，随着EMS处理浓度的增高和处理时间的延长，小麦种子的发芽率和发芽势越低、小麦胚乳消耗量、根部维管束面积和皮层面积减少得更快，根系也越细，其各项生物量都发生显著变化。李颜方等[28]采用梯度浓度的EMS和不同作用时间处理小麦种子，也发现小麦的发芽势、发芽率、茎长和胚根长都随着EMS浓度的增大而降低。另一方面，不同的EMS浓度和时间的处理组合能够诱导小麦种子获得理想株系。例如Lethin等[29]利用1% EMS浓度使小麦种子诱变，其中有部分株系表现出矮化、植株巨大、开花早等特性。Singh等[30]使用1.5% EMS处理不同品种的小麦，使这些品种的小麦获得了更利于生长的特性，在干旱、高温等条件下具有了更好的耐受性。武银玉用0.8% EMS浸泡‘晋麦90号’小麦种子10 h后创造出抗寒性好的突变体[31]和具有抗旱性的突变体[32]。孙玉龙[33]用0.4% EMS浸泡14 h后获得具有优良性状的‘盛农1号’突变体。此外在前人研究中，通过采用梯度浓度的EMS和不同作用时间处理小麦种子，分析比较不同组合处理的效果，最终确定‘晋谷21号’最佳诱变条件为 1.0% EMS/10 h[28]，‘西农99’、‘西农979’、‘西农977’和‘小偃22’的最佳处理组合分别为1.0% EMS/10 h、1.0% EMS/8 h、1.0% EMS/12 h和1.0% EMS/12 h[34]。本研究中处理组合为1.4% EMS/14 h下，小麦‘扬麦15’种子发芽率和发芽势最低，幼苗根部维管束和皮层面积最小，根系最细。

综上所述，EMS处理会降低小麦种子的发芽率，减缓种子贮藏物质的降解速度，抑制小麦根系的生长。同时，EMS也能诱导小麦种子获得理想突变体，产生优良性状。因此，可以通过适当的EMS处理来调控小麦的生长发育，但具体的处理浓度和生产应用还应根据具体材料进行更深入研究。