苦荞类黄酮糖基转移酶FtUFGT1的重组表达与酶学性质分析

李睿林，韩小韦，陈 鹏

(西北农林科技大学 生命科学学院，陕西杨陵 712100)

类黄酮是植物中最重要的次生代谢产物之一，其在植物应对生物胁迫、非生物胁迫中发挥重要的生物学功能[1-3]。同时作为食品的重要成分之一，黄酮类物质具有清除自由基、预防心脑血管疾病、抗衰老等营养保健功效，随着人们对健康的重视，类黄酮的种类及含量已逐渐成为衡量农产品品质的重要指标之一。类黄酮类物质在植物中主要以糖基化的形式存在。糖基化对于提高类黄酮物质的稳定性、水溶性及促进其积累和运输以及减少其自身的化学毒性等，对类黄酮生理功能的发挥起决定性的作用[4-6]。

类黄酮的糖基化由属于糖基转移酶超家族中第1家族的UDP-糖基转移酶催化，其以尿苷二磷酸(UDP)-糖作为活性糖基供体，催化UDP-糖(UDP-sugar)以糖苷键形式连接到类黄酮苷元或类黄酮糖苷分子上[5-7]。目前已在金鱼草(AntirrhinummajusL.)、马铃薯(SolanumtuberosumL.)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)等植物中克隆了糖基转移酶的基因。在拟南芥中 UGT 家族包括 120 个家族成员，这些家族成员参与如类黄酮、萜类、固醇、生物碱、酚类、蛋白质和脂质等的糖基化过程[8]。不同植物类黄酮的合成具有相对的保守性，同时也具有明显的种属特异性，种属特异性是不同植物类黄酮结构多样性的主要原因[9]。苦荞含有丰富的黄酮类物质，鉴定参与其黄酮类物质糖基化修饰的糖基转移酶基因在研究类黄酮代谢调控研究中有重要的基础性地位。另外，分析黄酮类物质糖基化修饰相关酶的催化特性，将为在体外条件下利用特异的糖基转移酶催化高附加值的黄酮类次生代谢物的合成奠定基础[10]。

本研究在分析苦荞转录组数据库的基础上筛选苦荞类黄酮糖基转移酶基因FtUFGT1，构建该基因的原核表达载体并实现其可溶性表达，采用高效液相色谱鉴定重组FtUFGT1的催化活性和部分酶学性质，以期为深入分析苦荞FtUFGT1相关的次生代谢调控、生物学功能及在体外条件下合成高纯度的糖基化次生代谢物奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

九江苦荞，原核表达载体pGEX-6P-1、大肠杆菌(Escherichiacoli)TOP10、Rosetta(DE3)菌株由陈鹏教授实验室保存。槲皮素、异槲皮素标样为上海源叶生物科技有限公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1FtUFGT1基因的克隆苦荞叶片总RNA的提取参照Concert Plant RNA Reagent说明书进行。电泳检测RNA的质量并利用NanoDrop核酸检测仪测定浓度。以总RNA为模板，参照TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT Reagent Kit反转录试剂盒进行cDNA第一链的合成。根据转录组数据库分析获得的FtUFGT1完整ORF区序列，设计带有pGEX-6p-1载体同源臂序列的引物UFGT1-F(TGTTCCAAGGTCCACTGGGATCCACGGTAT-CTTCCGCCACC)和UFGT1-R(GCTCGAGTC-GACCCGGGAATTCTTAGGTTGTGATGATGC-TAATGAACT)。以苦荞cDNA作为模板，通过PCR反应扩增FtUFGT1基因，反应总体系为25 μL，含cDNA模板1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×HiProof PCR Mix12.5 μL，H2O 9.5 μL。PCR反应程序如下：95 ℃变性3 min；95 ℃变性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸45 s，6个循环；95 ℃变性20 s，68 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s，32个循环；72 ℃终延伸7 min。1%琼脂糖凝胶检测FtUFGT1基因扩增产物并进行切胶回收。

使用NEBuliderHiFi DNA Assembly Cloning Kit以无缝克隆方式将带有pGEX-6p-1同源臂序列的FtUFGT1片段连接到经BamH I和SalI线性化pGEX-6p-1表达载体上。连接产物采用热激法转化TOP10感受态细胞并涂布于含100 μg/mL 氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)LB平板上，37 ℃培养过夜。经菌落PCR鉴定为阳性的克隆送西安擎科生物技术有限公司测序。测序正确的克隆命名为pGEX-6p-1-UFGT。

1.2.2FtUFGT1的生物信息学分析使用NCBI的在线Blast软件(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对FtUFGT1的氨基酸序列进行比对分析。通过ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)对各基因编码蛋白的分子量大小及等电点进行预测。使用Pfam(http://pfam.xfam.org/search)在线软件预测各蛋白质的结构域。采用ClustalX软件对FtUFGT1进行多序列比对后，使用ESPript(http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)在线作图。选择MEGA6软件的N-J法构建出系统发育树，并生成图像。序列比对中所用的其他物种的UGT序列皆来自https://www.ncbi.nlm.nih.gov/。

1.2.3 FtUFGT1蛋白的重组表达与纯化用pGEX-6p-1-UFGT载体转化Rosetta(DE3)感受态，复苏后菌体涂布于含25 μg/mL氯霉素(chloramphenicol，Cam)和100 μg/mL Amp的LB平板上，37 ℃培养过夜。挑取单克隆菌落，加入3 mL LB(Cam，Amp)中，37 ℃培养至OD600约为1.0时，将菌液以1∶100的比例转接至150 mL含Cam和Amp的LB培养基中，37 ℃培养。OD600达到0.6时，加入IPTG至终浓度0.6 mmol/L，20 ℃诱导14 h。4 ℃、10 000 r/min 离心收集菌体，加入50 mL预冷GST破菌缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，pH7.6)，超声裂解。4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，取上清。采用GST-resin纯化重组表达的蛋白，纯化方法参考GST-Resin的说明书进行，含FtUFGT1的洗脱组分采用30 kD超滤管进行超滤浓缩和缓冲液交换，加入甘油至终浓度为50%(V/V)，置-20 ℃保存。

1.2.4 FtUFGT1活性的HPLC检测参照Li等的方法检测重组FtUFGT1的活性[11]。反应体系的总体积为40 μL,含有400 μmol/L UDP-葡萄糖，80 μmol/L槲皮素，50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，及0.5 μg重组FtUFGT1。在30 ℃水浴锅中反应1 h，加入4倍体积甲醇终止反应。以沸水加热灭活的酶为对照。将反应组和对照样品12 000 r/min离心20 min，用0.22 μm有机相滤膜过滤后取10 μL利用HPLC进行分析。采用色谱柱为C18柱，流动相为10%甲酸水溶液和10%甲酸乙腈溶液。测定时柱温箱设为30 ℃，紫外检测器波长设定在360 nm；流动相为10%甲酸水溶液(A)和10%甲酸乙腈溶液(B)。样品在0～25 min内B由5%梯度增至15%；25～42 min，B由15%增至22%；42～60 min，B由22%增至36%；60～65 min，B由36%降至5%；最后以95%A和5%B等度洗脱10 min。流速1 mL/min。设置浓度范围为1～1 000 μg/mL异槲皮素溶液，利用HPLC分析并绘制标准曲线。将30 ℃反应10 min合成1 μmol槲皮素所需的酶的量定义为1个酶活力单位(U)。

1.2.5 FtUFGT1的酶学性质分析参考1.2.4的方法，分别在20～60 ℃下反应10 min，通过HPLC测定反应体系异槲皮素的浓度，分析不同温度对FtUFGT1活性的影响；分别在pH3.0～10.0条件下30 ℃反应10 min，通过HPLC测定异槲皮素的浓度并分析不同pH值对FtUFGT1活性的影响；在反应体系中分别加入0～20%(V/V)甲醇、或0.5%～2% Triton X-100，在30 ℃反应10 min，通过HPLC测定异槲皮素的浓度并分析不同浓度甲醇及Triton X-100对FtUFGT1活性的影响。

1. FtUFGT1； M. DL2000图1 FtUFGT1基因的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of FtUFGT1 gene

2 结果与分析

2.1 FtUFGT1基因的克隆

以九江苦荞cDNA为模板，以FtUFGT1-F/FtUFGT1-R为引物进行PCR扩增，琼脂糖电泳显示(图1)，条带明亮且单一，扩增产物约为1 400 bp，与预期大小基本一致。

2.2 FtUFGT1生物信息学分析

测序结果显示FtUFGT1的ORF区全长为1 413 bp，编码470个氨基酸。经ExPASy等分析，FtUFGT1蛋白的相对分子量为50.25 kD，等电点为5.60，不稳定指数为47.96。推测在65～453肽段含有UDPGT(UDP-Glycosyltrans ferase)结构域。氨基酸序列比对发现，FtUFGT1与甜荞(Fagopyrumesculentum)中的类黄酮C-糖基转移酶相似性最高，达到52.49%，与树棉(GossypiumarboreumL.)、紫牡丹(PaeoniadelavayiFranch.)和葡萄(VitisviniferaL.)等物种的UGT相似性为40%左右。在其C末端，含有由44个氨基酸构成保守序列——PSPG盒(图2)。从系统发育树可以看出，FtUFGT1与甜荞中的UGT处于进化树的同一分支，两者进化关系最近(图3)。

下划线为C-末端PSPG盒图2 FtUFGT1与其他植物UGT的氨基酸序列比对The underline shows the C-terminal PSPG box of FtUFGT1Fig.2 Amino acid sequences alignment of FTUFGT1 and UGTs from other plants

图3 FtUFGT1与不同植物中UGT氨基酸序列的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of FtUFGT1 and UGTs from other plants

2.3 FtUFGT1的重组表达与纯化

pGEX-6p-1-FtUFGT1载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞，与未诱导的菌体相比，IPTG诱导的菌体在SDS-PAGE上显示一条约为80 kD的蛋白，其大小与目标蛋白的分子量基本一致。将诱导后的菌体超声破碎，分别取破菌的上清与沉淀进行SDS-PAGE分析，结果显示上清和沉淀中均存在一条约80 kD的条带，但上清中的可溶性形式表达量明显高于沉淀形式。表明FtUFGT1蛋白在Rosetta(DE3)中主要以可溶形式表达。裂解诱导菌体获得的上清，通过GST-resin亲和层析柱进行纯化。分析显示，洗脱液中存在 0.1%TritonX-100溶液条件下，纯化的FtUFGT1蛋白在SDS-PAGE凝胶上表现单一条带(图4)。

2.4 重组FtUFGT1活性的检测

HPLC分析显示，以槲皮素为底物，重组FtUFGT1可以催化生成与异槲皮素相同保留时间的产物(图5)，说明重组FtUFGT1具有糖基转移酶活性，它在体外能以槲皮素为糖基受体，将活化糖供体UDP-葡萄糖的葡萄糖基缀合到槲皮素的3-OH上生成异槲皮素。将30 ℃反应10 min合成1 μmol槲皮素所需酶的量定义为1个酶活力单位(U)，在该定义条件下，FtUFGT1的比活力为9.174 U/mg。

2.5 重组FtUFGT1活力的影响因素

分别在20～60 ℃测定重组FtUFGT1对槲皮素的糖基化活性。在20～30 ℃内，FtUFGT1活性随着温度升高而增加，在30 ℃时，FtUFGT1具有最高活性。温度高于30 ℃，FtUFGT1活性随着温度升高而降低。FtUFGT1的最适温度为30 ℃(图6，A)。分别在pH 3.0～10.0范围内测定FtUFGT1的活性。在pH3.0～7.0范围内，FtUFGT1活性随着pH值升高而增加，在pH7.0时活性达到最高。而在pH大于8.0时，FtUFGT1活性随着pH值升高而骤降。FtUFGT1在pH6.0～8.0范围具有较高活性，其最适pH为7.0(图6，B)。在反应体系中加入5%～20%的甲醇，当反应体系甲醇浓度为5%时，FtUFGT1活性即出现大幅降低，活性仅为无甲醇条件下的10%左右。由此表明FtUFGT1对反应体系中的甲醇耐受性较低(图6，C)。同样的方法分析发现，0.5%的TritonX-100可以抑制FtUFGT1的活性，且在0.5%～2%TritonX-100范围内，酶活性变化不明显(图6，D)。

1.未诱导；2.诱导；3.超声破菌上清；4.超声破菌沉淀；5.纯化的FtUFGT1；M. 蛋白Marker图4 FtUFGT1的诱导表达、可溶性以及纯化的SDS-PAGE分析1. Uninduced cell; 2. Induced cell; 3. Supernatant; 4. Precipitate; 5. Purified FtUFGT1; M. Protein markerFig.4 SDS-PAGE analysis the overexpression and purification of FtUFGT1

图6 反应温度(A)、pH(B)、甲醇(C)和TritonX-100(D)对FtUFGT1活性的影响Fig.6 Effect of reaction temperature(A), pH(B), methanol(C) and TritonX-100(D) on the activity of FtUFGT1

3 讨 论

类黄酮糖基转移酶在植物体内次生代谢物糖基化修饰中发挥核心的功能。糖基化调控黄酮类物质的稳定性、溶解度、胞内定位、运输方式，进而影响次生代谢物在植物体内的功能[12-13]。已有的研究证实次生代谢相关糖基转移酶与植物的抗逆性相关，但研究结果主要集中在拟南芥上，且研究结果存在明显的差异性。拟南芥类黄酮糖基转移酶UGT73B2缺失的植株表现对氧化胁迫的抗性增强，而过表达UGT73B2的拟南芥则表现对氧化胁迫高度敏感，推测缺失ugt73b2突变体黄酮类单体化合物含量升高，增强了植物对胁迫的抗性[14]。过表达低温、盐及干旱胁迫强烈诱导的矢车菊素糖基转移酶UGT79B2/B3的拟南芥中花青素含量增加，植株对低温、干旱和盐胁迫的耐受性增强，而ugt79b2/b3双突变体的花青素含量下降，表现对环境胁迫的敏感度增加，进而在不能合成花青素的拟南芥突变体tt18中过表达UGT79B2/B3不能提高植株的抗逆性，说明UGT79B2和UGT79B3通过调节花青素的含量提高拟南芥对非生物胁迫耐受性[15]。鉴于不同植物次生代谢物累积的差异性，鉴定不同植物来源的糖基转移酶并揭示其生物学功能对于植物次生代谢途径在抗逆中的生物学功能有重要的价值。苦荞是中国西部地区的特色药粮兼用高抗逆作物，其富含黄酮类物质，鉴定苦荞中的特异性黄酮糖基转移酶基因并揭示其抗性的机制及调控苦荞次生代谢物的累积有重要的意义。本研究基于苦荞的转录组数据，在生物信息学分析基础上，根据UDPGT结构域及PSPG盒筛选确定苦荞类黄酮糖基转移酶FtUFGT1基因，实现了其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中的可溶性表达，纯化的FtUFGT1可催化槲皮素糖基化合成异槲皮素，进一步证明所克隆基因的正确性，研究结果为深入研究该基因的植物学功能及苦荞次生代谢生物异槲皮素合成的调控机制奠定了基础。

苦荞含有丰富的次生代谢物，在本研究过程中，利用常规的RNA提取试剂如Trizol无法提取获得RNA[16-18]，提取过程中氯仿进行上下相分离获得的RNA提取物异常黏稠，无法进行后续的沉淀等步骤，其可能原因是苦荞叶片中存在高含量的多酚和多糖类化合物在提取过程中与RNA形成较为稳定的复合物[19]。为此在本研究系统中，利用含有高浓度β-巯基乙醇的Invitogen公司的 ConcertTMPlant RNA Reagent 并结合酸性酚抽提，有效解决了苦荞叶片总RNA提取的问题，研究方法对其他高含多糖多酚植物材料的RNA提取有借鉴价值。在原核表达过程中，FtUFGT1在BL21(DE3)中无明显的表达(结果未显示)，但在补充稀有密码子的菌株Rosetta(DE3)中可以实现高效的表达，说明稀有密码子是限制其在BL21(DE3)中表达的主要因素。在纯化过程中，洗涤液中添加0.1% TritonX-100可以有效地去除GST-Resin非特异性结合的杂蛋白，在破菌上清中加入0.1 mmol/L的丝氨酸蛋白抑制剂(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)可有效消除内源蛋白酶对FtUFGT1降解引起的高度不稳定问题。

异槲皮素是天然黄酮醇(3,5,7,3′,4′-五羟基黄酮)主要糖苷形式之一，其在生物安全性和生物活性等方面较槲皮素和芦丁更具有优势[20]。本研究实现了苦荞中可催化槲皮素形成异槲皮素的糖基转移酶FtUFGT1的重组表达与纯化，为通过体外合成制备异槲皮素奠定了基础工作。