大花君子兰大小孢子发生与雌雄配子体发育的研究

李芳弟，马璐璐，申家恒，华 月，王文希，李 伟*

(1 哈尔滨师范大学 生命科学与技术学院，黑龙江省植物学省级重点实验室，哈尔滨 150025；2 北京市密云水库中学，北京 101500)

君子兰为石蒜科(Amaryllidaceae)君子兰属(Clivia)多年生草本植物，原产南非，为著名的温室观赏植物[1]，亦可入药[2-3]。关于君子兰生理特性、栽培育种、品种选育等方面已有报道[4-6]，而君子兰生殖生物学研究较少，仅Barbro[7]和姜闯等[8]对君子兰花粉粒超微结构进行了描述；Ryczkowski等[9-11]进行了君子兰胚胎发育过程的组化研究；唐佩华[12-13]对垂笑君子兰(Clivianobilis)雄配子体发育过程中营养核与生殖细胞的动态及其细胞化学特性进行了研究；申家恒等[14]报道了大花君子兰花粉贮藏寿命及受精过程。对于君子兰大小孢子发生与雌雄配子体发育过程方面的研究尚未见报道。本研究以大花君子兰为试材，在显微水平详尽描述了大花君子兰(CliviaminiataRegel)大、小孢子发生与雌、雄配子体发育的过程，并记录了雌、雄配子体发育的对应关系，揭示其杂交育种中不易受精、胚珠败育率高、结籽率低的原因，为种子发育和育种提供理论参考，完善君子兰生殖生物学资料。

1 材料和方法

以大花君子兰(CliviaminiataRegel)为研究对象，温室培育，白天室温为18～22 ℃，夜间为16～18 ℃。2015-2018年，每年12月至翌年3月，取大小不同的花蕾及开花后子房进行分组固定，每组固定10个材料。经FAA固定液处理4 h后转入70%酒精内，于冰箱-4 ℃冷藏保存。经爱氏苏木精整体染色，常规石蜡切片法制片，切片厚度8 μm。Nikon Ci L光学显微镜下观察并摄影。

2 结果与分析

大花君子兰为伞形花序，顶生。每个花序具10～40朵小花，两性花，每朵小花6枚雄蕊，1枚雌蕊。花序的开花顺序为顶端先开，两侧对开[15]。开花时，雌蕊伸出花瓣之外，比花药高，防止自花授粉。开花第2天，花药开裂，散出花粉，雌蕊柱头出现分泌物，但雌蕊胚珠发育不同步。

2.1 小孢子发生与雄配子体发育

2.1.1 小孢子发生大花君子兰每朵小花具6枚雄蕊，每枚雄蕊具4个药室。从雄蕊原基横切面上看，4个角隅处分化出单个孢原细胞，孢原细胞平周分裂形成初生壁细胞与初生造孢细胞。初生造孢细胞经多次有丝分裂产生次生造孢细胞，次生造孢细胞进一步发育为小孢子母细胞。小孢子母细胞时期，花药壁分化完成，自外向内分别为表皮、药室内壁、中层及绒毡层，绒毡层为分泌型。从花药的横切面上显示，每个小孢子囊内小孢子母细胞紧密排列，呈多边形，细胞体积较大，细胞质浓厚，细胞核明显，核仁与染色质呈染色深的圆球体，易于与花药壁细胞区分(图版Ⅰ，1)。

随着发育进行，小孢子母细胞由多边形变成球形，并被胼胝质壁包裹，进入减数分裂期。小孢子母细胞减数分裂过程与大多数被子植物相似，经历减数分裂前期Ⅰ的细线期(图版Ⅰ，2)、偶线期(图版Ⅰ，3)、粗线期(图版Ⅰ，4)、双线期(图版Ⅰ，5)、终变期(图版Ⅰ，6)、中期Ⅰ(图版Ⅰ，7)、后期Ⅰ(图版Ⅰ，8)、末期Ⅰ(图版Ⅰ，9)，具明显的成膜体及细胞板，形成典型二分体(图版Ⅰ，10)。随后，经减数第二次分裂前期Ⅱ(图版Ⅰ，10)、中期Ⅱ(图版Ⅰ，11)、后期Ⅱ(图版Ⅰ，12)、末期Ⅱ(图版Ⅰ，13)，形成四分体(图版Ⅰ，14)。可见，大花君子兰小孢子母细胞的胞质分裂为连续型，产生的四分体为左右对称型(图版Ⅰ，14)。同一药室的小孢子母细胞减数分裂趋于同步，不同药室之间存在2-3个时相差异。小孢子母细胞减数分裂过程始终被胼胝质壁包围，因而，所形成的小孢子四分体亦被胼胝质壁包裹。待四分体胼胝质壁被胼胝质酶水解之后，小孢子被释放至药室内，至此单核小孢子形成(图版Ⅰ，15)。

2.1.2 雄配子体发育单核小孢子为雄配子体的第1个细胞。刚释放的单核小孢子呈椭球状，细胞核较大，位于细胞中央，细胞质浓厚，液泡尚不明显，花粉壁尚未加厚(图版Ⅰ，15、16)。随着液泡化进行，单核小孢子内形成大液泡，细胞形态变得不规则，并将细胞核挤向花粉壁一侧，进入单核靠边期(图版Ⅰ，17)。随即，小孢子核在靠近花粉壁的位置进行不均等的有丝分裂，经过前期(图版Ⅰ，17)、中期(图版Ⅰ，18)、后期(图版Ⅰ，19)、末期(图版Ⅰ，20)，形成营养细胞和生殖细胞，即二细胞花粉(图版Ⅰ，21)。

二细胞花粉的营养细胞较大，占据花粉大部分体积，核呈球形，核仁显著；生殖细胞较小，球形，具较为明显的胞质鞘，染色质凝集(图版Ⅰ，21)。初期，花粉形态仍不规则，但细胞质逐渐增加，体积逐渐增大，液泡明显减小至不可见，花粉壁逐渐加厚(图版Ⅰ，21-23)。至花粉成熟，营养细胞内充满了贮藏的营养物质，营养细胞核由球形变为不规则的裂瓣状；而生殖细胞由球形纵向延长，呈长椭球形(图版Ⅰ，24、25)。以上结果表明，大花君子兰的成熟花粉为二细胞型，具2个萌发孔。

图版Ⅰ 小孢子发生与雄配子体的发育1.小孢子母细胞；2.小孢子母细胞减数分裂前期Ⅰ细线期；3.偶线期；4.粗线期；5.双线期；6.终变期；7.中期Ⅰ；8.后期 Ⅰ；9.末期 Ⅰ；10.二分体前期 Ⅱ；11.中期 Ⅱ；12.后期 Ⅱ；13.末期 Ⅱ；14.左右对称型四分体；15、16.单核小孢子；17.单核靠边期，有丝分裂前期；18.单核小孢子有丝分裂中期；19.单核小孢子有丝分裂后期；20.单核小孢子有丝分裂末期；21-23.二细胞花粉早期(箭头示胞质鞘)；24-25.成熟的二细胞花粉(箭头示长椭形生殖细胞)(图1, ×125倍；图2-25, ×500倍)PlateⅠ Microsporogenesis and the development of male gametophytesFig.1. Microspore mother cell; Fig.2. The microspore mother cell is in leptonema of prophase Ⅰ of meiosis of the first division; Fig.3. Zygonema; Fig.4. Pachynema; Fig.5. Diplonema; Fig.6. Diakinesis; Fig.7. Metaphase Ⅰ; Fig.8. Anaphase Ⅰ; Fig.9. Telephase Ⅰ; Fig.10. Prophase Ⅱ of dyad; Fig.11. Metaphase Ⅱ; Fig.12. Anaphase Ⅱ; Fig.13. Telephase Ⅱ; Fig.14. Isobilateral tetrad; Fig.15-16. Monokarytic microspore; Fig.17. Mononuclear pollen edging phase and in prophase of mitosis; Fig.18. Mononuclear pollen in metaphase of mitosis; Fig.19.Mononuclear pollen in anaphase of mitosis; Fig.20. Mononuclear pollen in telephase of mitosis; Fig.21-23. Early two-celled gametophyte (plasmic envelope is showed by arrows); Fig.24-25. Mature gametophyte(Long ellipsoid germ cell is showed by arrows). (Fig.1, ×125; Fig.2-25, ×500)

2.2 大孢子发生与雌配子体发育

大花君子兰为3室子房，中轴胎座，每室2列胚珠，每列3至4枚胚珠，胚珠倒生，双珠被，厚珠心，雌配子体发育类型为蓼型。

2.2.1 大孢子发生孢原细胞位于珠心表皮下方，与周围珠心细胞相比，其细胞体积大，细胞质浓厚，细胞核明显(图版Ⅱ，1)。孢原细胞经平周分裂产生周缘细胞和造孢细胞。造孢细胞进一步发育为大孢子母细胞(图版Ⅱ，2)，大孢子母细胞与珠心表皮细胞之间有细胞间隔，故大花君子兰为厚珠心。

大孢子母细胞纵向伸长，随即进入减数分裂期。与小孢子母细胞的减数分裂进程相似，大孢子减数第一次分裂前期Ⅰ经历时间较长。细线期细胞核内的染色质凝聚成花束状，围绕核仁周围(图版Ⅱ，3)；经偶线期(图版Ⅱ，4)、粗线期(图版Ⅱ，5)、双线期(图版Ⅱ，6)、终变期(图版Ⅱ，7)，染色体缩短变粗，并逐渐沿核膜排列。经中期Ⅰ(图版Ⅱ，8)、后期Ⅰ形成二分体(图版Ⅱ，9)；经减数第二次分裂形成四分体。靠近珠孔端的3个大孢子退化，合点端的大孢子发育为功能大孢子(图版Ⅱ，10)。

2.2.2 雌配子体发育功能大孢子为雌配子体的第1个细胞，随液泡化进行，其细胞体积不断增大，进而发育为单核胚囊(图版Ⅱ，11)；单核胚囊经有丝分裂形成二核胚囊(图版Ⅱ，12)，其两核分别位于胚囊的珠孔端和合点端，中央为大液泡所隔；二核胚囊经有丝分裂形成四核胚囊(图版Ⅱ，13)，胚囊的中央被大液泡占据；四核胚囊经有丝分裂形成八核胚囊，此时期非常短暂，很快便细胞化，发育为成熟胚囊(图版Ⅱ，14)。

胚囊珠孔端为卵器，卵细胞与两助细胞呈“品”字形排列(图版Ⅱ，15)。卵细胞呈洋梨形，高度液泡化，细胞核大并位于合点端，细胞极性明显(图版Ⅱ，16)。2个助细胞在分化早期呈楔形，胞质浓厚，细胞内看不到液泡，丝状器发达，染色深(图版Ⅱ，17)；随后，助细胞逐渐液泡化(图版Ⅱ，18、19)，并向胚囊内延伸(图版Ⅱ，20)，胞质及丝状器均变浅。中央细胞体积大，两极核或次生核位于合点端，靠近反足细胞(图版Ⅱ，21-24)。卵器与次生核之间为大液泡所隔，中央细胞的细胞质沿胚囊壁分布，联系卵器与次生核。3个反足细胞在成熟胚囊时期呈退化状态(图版Ⅱ，24)。在胚囊下方、合点端上方具承珠盘，由一群形态不规则、体积小、胞质少且细胞壁厚的珠心细胞堆叠而成(图版Ⅱ，25)。可见，大花君子兰的雌配子体发育类型为单孢型中的蓼型，具承珠盘结构。

图版Ⅱ 大孢子发生与雌配子体的发育1.孢原细胞；2.大孢子母细胞；3.大孢子母细胞减数分裂前期Ⅰ细线期；4.偶线期；5.粗线期；6.双线期；7.终变期；8.中期 Ⅰ；9.二分体；10.功能大孢子；11.单核胚囊；12.二核胚囊；13.四核胚囊；14.成熟胚囊；15.卵器；16.卵细胞；17.助细胞早期，箭头示丝状器；18.两个助细胞，呈楔形(箭头示丝状器)；19-20.助细胞液泡化，丝状器欠发达；21.中央细胞，两个极核靠近反足细胞；22-23.两个极核融合；24.次生核和反足细胞；25.承珠盘。(图14, ×125倍；图1-13、15-25, ×500倍)Plate Ⅱ Megaspore genesis and development of female gametophytesFig.1. Archesportial cell; Fig.2. Megaspore mother cell; Fig.3. Megasporocyte mother cell is in leptonema of prophase Ⅰ of meiosis; Fig.4. Zygonema; Fig.5. Pachynema; Fig.6. Diplonema; Fig.7. Diakinesis; Fig.8. Metaphase Ⅰ; Fig.9. Dyad; Fig.10. Functional megaspore; Fig.11. Mononuclear embryo sac; Fig.12. Two-nucleate embryo sac; Fig.13. Four-nucleate embryo sac; Fig.14. Mature embryo sac; Fig.15. Egg apparatus; Fig.16. Egg cell; Fig.17. The early synergid with filiform apparatus is shown by arrows; Fig.18. Two synergids are wedge (filiform apparatus is shown by arrows); Fig.19-20. Synergid vacuolization, filiform apparatus underdeveloped; Fig.21. Central cell and two polar nuclei near the antipodal cells; Fig.22-23. Two polar nucleus fuse; Fig.24. Secondary nucleus and antipodal cell; Fig.25. Hypostase.(Fig.14, ×125; Figs.1-13, Figs.15-25, ×500)

2.3 花蕾大小与雌雄配子体发育的相关性

大花君子兰雄蕊发育趋于同步，且雄蕊发育快于雌蕊。开花散粉时，雄蕊已发育为成熟的二细胞型花粉，而雌配子体尚处于四核、八核胚囊时期，发育不同步。具体对应关系见表1。

表1 花蕾长度与雌雄配子体发育的关系

3 讨 论

大花君子兰的胚胎学特征基本符合石蒜科胚胎学特征[16]。值得注意的是，大花君子兰成熟胚囊的合点端具承珠盘结构，这在石蒜科其他植物中未见报道[17-19]。

3.1 承珠盘的结构与功能

目前，已在多种被子植物中发现了承珠盘结构[20-21]。本研究中，大花君子兰成熟胚囊下方与合点维管束之间多层厚壁细胞突向胚囊，形成明显的承珠盘结构，与胡适宜[22]报道的承珠盘典型特征一致，却与绿豆中[23]描述的由薄壁细胞组成承珠盘结构不同。

大花君子兰成熟胚囊时期，胚囊较大，近球形，而承珠盘在胚囊的基部形成了一个坚实的屏障，可以防止胚囊过度扩大，这与宁夏枸杞[24]等植物中承珠盘的功能一致。另外，大花君子兰承珠盘位于合点端维管束的上方，其基部1～3层珠心细胞呈退化状态，明显区别于其他珠心细胞，推测承珠盘具向胚囊转输水分及营养物质的功能，而这与绿豆[23]中描述的承珠盘功能相似。

3.2 丝状器的结构与功能

其他石蒜科植物(水仙、葱兰等)的胚胎学研究中，均未报道丝状器结构[17-19]。而本研究发现大花君子兰胚囊成熟时期，助细胞珠孔端存在明显的丝状器，其形态与棉属植物[22]类似。大花君子兰中刚分化的助细胞丝状器发达，成熟胚囊时期，丝状器逐渐欠发达，这与申家恒等[14]的描述一致。推测其原因在于大花君子兰成熟胚囊时期已形成承珠盘，司营养物质转输功能，进而分担了助细胞丝状器营养转输压力。这与宁夏枸杞[24]中助细胞分化初期没有丝状器，在液泡化后才形成丝状器不同。

大花君子兰的花柱长50 mm，花粉管在花柱中行走大约26 h才到达子房腔，花粉管在子房内大约经历12 h后才进入助细胞[14]。花粉管之所以能准确到达助细胞，推测与助细胞通过丝状器分泌向化性物质有关。

3.3 君子兰的败育

君子兰杂交育种过程中发现其存在不易受精、胚珠败育率高、结籽率低的现象[14]。本研究从雌雄配子体发育角度揭示其原因如下：其一，大花君子兰雄蕊发育快于雌蕊，这与二倍体芒(DiploidMiscanthussinensis)[25]相似。且大花君子兰雌配子体发育不同步，开花散粉时，雌配子体的发育尚停留在四核以及八核胚囊时期，直至开花第2天，才发育至成熟胚囊阶段，具可授性；其二，大花君子兰成熟胚囊呈近球形，囊腔极大，且中央细胞极核、次生核始终位于合点端反足细胞附近，导致受精困难；其三，大花君子兰存在花粉空瘪、内容物缺失，即花粉败育的现象，这与姜闯等[8]的研究相同，与新小竹(Neomicrocalamusprainii)[26]药室中无花粉、药室收缩变形的败育现象不同。鉴于此，为提高其繁育率，提出以下建议：1) 在开花第二天即成熟胚囊阶段进行授粉；2) 增大授粉量或授粉频次；3) 选择可育花粉进行授粉。