基于网络药理学与分子对接探究甘草-泽泻药对治疗室性早搏的分子机制

岑崇民 唐玉玲

摘要：目的：探讨甘草-泽泻药对治疗室性早搏（premature ventricular contractions，PVCs）的潜在分子机制。方法：運用中药系统药理学分析平台TCMSP数据库、PubMed数据库、UniProt数据库筛选出甘草-泽泻药对的化合物成分以及靶点，利用GeneCards、OMIM、PharmGKB、DrugBank以及TTD数据库检索PVCs相关靶点，并运用Venny 2.1.0在线获取成分-疾病的交集靶点;采用STRING数据库构建成分-疾病交集靶点基因的蛋白质相互作用关系（PPI）网络并导入Cytoscape3.8.2软件进行拓扑学分析，筛选出每个条件大于中位值的靶点，即核心靶点;使用R语言Bioconductor程序包对成分-疾病共有靶点进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。以核心靶点所编码蛋白为受体、主要有效成分为配体，采用AutoDock Vina 1.1.2软件进行分子对接。结果：共挖掘出甘草-泽泻药对相关靶点206个、PVCs相关靶点3997个，两者共有靶点159个，其中核心靶点共4个。最终富集到GO功能条目2491个，KEGG信号通路186条。将受体与配体进行分子对接，任意两者结合能均低于-7 kcal/mol，有较强的结合活性。结论：甘草-泽泻药对治疗PVCs可能是槲皮素、山柰酚、甘草酮A、柚皮素、甲素通过调控TP53、JUN、MAPK1、MAPK3等核心靶点，作用于IL-17信号通路、TNF信号通路等而实现的。

关键词：  甘草-泽泻药对;室性早搏;网络药理学;分子对接;分子机制

【中图分类号】R28             【文献标识码】A             【文章编号】2107-2306（2021）09--05

0 引言

室性早搏又称为室性前期收缩，是一种最常见的心律失常，是指房室束分叉以下部位过早发生提前心室肌除极的心搏。正常人也会引起室性早搏，大部分患者在生活中没有任何临床表现，部分患者可表现出心慌、胸闷、心跳停搏。室性早搏也可以见于一些药物中毒、过量饮酒、电解质紊乱的患者。目前传统的治疗方法主要有导管消融治疗以及西医药物治疗，西医药物治疗包括β受体阻滞剂、胺碘酮等。室性早搏在祖国医学中属“心悸”范畴，中医治疗以补气养血、滋阴温阳、祛痰行瘀、清火为基本原则。但中医药治疗室性早搏的相关分子机制并未完全阐明，这制约中医药理论向临床实践的转化。

生物信息分析是从大量的基因数据库中筛选出与疾病发生的相关基因。两者的相结合，解析药物与治疗对象之间的分子关联规律、整体作用机制的阐释。本文章主要是通过此方法探索甘草-泽泻药对治疗室性早搏的分子机制，促使人们发现更多中医药对治疗PVCs的新思路。

1 资料和方法

1.1  中药有效成分筛选及靶点筛选

通过TCMSP数据库分别提取甘草、泽泻所含化合物成分。以口服生物利用度（OB）≧30%并且类药性（DL）≧0.18为筛选条件，选出甘草、泽泻药效成分以及相对应靶点，并采用SwissTargetPrediction数据库对药物靶点进步补充。根据Uniprot数据库对靶点进行基因名转化以及标准化，删除无基因名的靶点，将两者化合物成分以及靶点分别进行合并、去重，将结果导入Cytoscape3.8.2软件中进行数据分析，获得核心化合物成分。

1.2  疾病靶点筛选

基于Genecards、Drugbank、Omin、TTD以及Pharmgkb数据库，物种设定为“Homo sapiens”，以“premature ventricular contractions”为关键词检索相关疾病靶点，合并、去重后获得疾病靶点。

1.3  获取药物-疾病交集靶点

利用在线网站Venny2.1.0绘制药物-疾病靶点韦恩图，其交集靶点即为药物对治疗PVCs潜在作用靶点。

1.4  构建蛋白相互作用PPI网络图

将交集靶点导入string 11.5数据库中进行蛋白相互作用分析，设置最高置信度为0.9，隐藏网络中游离节点，利用Cytoscape3.8.2软件中CytoNCA工具筛选出核心作用靶点。

1.5  GO和KEGG富集分析

基于R语言中Bioconductor程序包对“1.3”获得的交集靶点进行基因本体功能分析（GO）、京都基因与基因组百科全书富集分析（KEGG），并绘制柱形图、气泡图、通路图。

1.6  分子对接

以“1.1”获得的核心化合物成分为配体，核心靶点编码蛋白为受体进行分子对接。从PubChem数据库下载核心化合物的2D结构，并对其进行优化。采用AutoDockTools 1.5.6软件将“.mol2”格式转换为“.pdbqt”格式。从PDB数据库中下载核心靶点编码蛋白的3D结构，并利用PyMol软件去除受体蛋白结构中的配体分子以及水分子。使用AutoDockTools 1.5.6对蛋白结构进行预处理。采用AutoDock Vina 1.1.2软件分别对受体和配体分别进行对接，以最低结合能作为评判分子对接结果标准。两者结合能越低，表明结合力越强，配体与受体能够自发结合，且其值越小表示两者的结合活性越高。利用在线分析网站PLIP对结果进行蛋白配体非共价相互作用分析，最后使用PyMOL 2.3软件进行部分对接结果可视化展示。

2 结果

2.1  中药有效成分筛选及靶点处理

通过TCMSP数据库检索共收集到甘草-泽泻药对有效成分290个，对应靶点基因 1770个，通过Uniprot数据库对把靶点进行基因名标准化，并删除重复项，得到206个中药靶点。将“中药-化合物成分-靶点”导入Cytoscape3.8.2软件中进行数据分析，以“degree”为筛选标准，筛选出核心化合物成分（图1）。

2.2  疾病靶点处理

以“premature ventricular contractions”为检索关键词，物种条件设定为“Homo sapiens”，通过Genecards数据库检索，获到3080个靶点基因;通过 Drugbank数据库检索，得到4个靶点基因;通过Omin数据库检索，获得59个靶点基因; 通过Pharmgkb数据库，获得1519个靶点基因。将所获得靶点基因进行合并、去重，最终获得3997个疾病靶点，并利用在线网站Venny2.1.0绘制疾病靶点韦恩图。（图2）。

2.3  疾病靶点与中药化合物成分靶点韦恩图

利用在线网站Venny 2.1.0将“1.1”“1.2”所获得数据进行映射，获得中药-疾病共同靶点159个，并绘制中药-疾病韦恩图（图3）。

2.4  共同靶点的蛋白质相互作用关系网络（PPI）的构建及拓扑学分析

将“2.3”获得的共同靶点基因导入string 11.5数据库进行分析，物种设定为“homo sapiens”，最高置信度设为0.9，隐藏网络中游离节点，构建蛋白质相互作用网络关系图（图4），该图共有158个节点，575条边，平均节点7.28。将构建结果导入Cytoscape 3.8.2软件中进行数据分析，利用CytoNCA工具，将“Betweenness”、“Closeness”、“Degree”、“Eigenvector”、“LAC”、“Network”设为过滤条件，过滤3次，每次筛选出每个条件大于中位值的基因。最终TP53、MAPK3、JUN、MAPK1各个筛选条件均大于中位值，即为核心靶点基因（图5）。

2.5   GO富集分析及KEGG通路富集分析

基于R语言中Bioconductor程序包对中药-疾病共同靶点基因进行GO、KEGG富集分析。GO分析包含分子功能（MF）、生物过程（BP）、细胞成分（CC）等功能，最终富集到GO功能条目2491个。其中，生物过程（Biological Process，BP）2212个，包含对药物的反应、对脂多糖的反应、对细菌源分子的反应、对金属离子的反应、对细胞外刺激的反应等;分子功能（Molecular Function，MF）197个，包含DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合、泛素样蛋白连接酶结合、丝氨酸/苏氨酸激酶活性、内肽酶活性等;细胞成分（Cellular Component，CC）82个，包含膜筏、膜微区、质膜外侧、神经元胞体质、膜筏等。将富集结果以P<0.05为筛选条件，按校正后P值依次从小到大排序，选取排名前10个条目进行绘制GO富集分析柱形图（图6）、气泡图（图7）。

富集到KEGG信号通路186条，包含IL-17信号通路、TNF信号通路等。将富集结果以P<0.05为篩选条件，按校正后P值依次从小到大排序，选取排名前10个条目进行绘制KEGG富集分析柱形图（图8）、气泡图（图9），并以“IL-17 signaling pathway”绘制通路图（图10）。

2.6  分子对接验证结果

使用AutoDock Vina 1.1.2软件将“2.4”中获得的核心靶点基因编码蛋白（TP53（1YC5）、MAPK3（4QTB）、JUN（5T01）、MAPK1（2Y9Q））与“2.1”中的得到的核心有效成分槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、甘草酮A（licochalcone a）、柚皮素（naringenin）、甲素（formononetin）分别进行对接，结果显示任意两者对接结合能均小于-7.0 kcal/mol（图11）。其中，MAPK3与所有配体分子对接，结合能均小于-9.0 kcal/mol，表明所有配体分子对MAPK3具有较强结合力，结合最稳定。PLIP （Protein-Ligand Interaction Profiler） 是蛋白配体非共价相互作用的分析工具，利用在线网站PLIP对蛋白配体进行分析，通过PyMol对部分结果进行数据可视化（图12-15）。图中formononetin与MAPK1中的氨基酸残基ASP106、MET108形成氢键，与氨基酸残基ILE31、VAL39、ALA52、LYS54、LEU156形成疏水作用;formononetin与MAPK3中的氨基酸残基ILE48、ALA69、LYS71形成疏水作用，与氨基酸残基MET125、ASP184形成氢键作用。Kaempferol与MAPK3中的氨基酸残基ILE48、LEU173、LYS71形成疏水作用，与氨基酸残基MET125、ASP184、LYS71、SER170形成氢键作用。naringenin与MAPK3中的氨基酸残基ILE48、LEU173、LYS71、ALA69形成疏水作用，与氨基酸残基MET125、ASP184、LYS71形成氢键作用。Formononetin、Kaempferol、naringenin均与MAPK3中氨基酸残基TYR53形成π堆积作用。以上结果间接证明，甘草-泽泻药对主要有效成分对核心靶点起到调控作用。

3 讨论

室性早搏在中医学中属“心悸”范畴，源由年老体虚、感受外邪、七情所伤、药食不当等因素引起，治疗当以补气养血、滋阴温阳、祛痰行瘀、清火为原则，辨证施治。古籍中有关甘草、泽泻治疗实性早搏的记载由来已久。陶弘景《本经别录》中有甘草具有“通经络，利气血”之能。临床上也有运用中药甘草、泽泻治疗室性早搏案例，均取得比较好的临床疗效。

本研究筛选出甘草-泽泻有效化合物成分290个，对应靶点1770个，根据Cytoscape3.8.2软件分析可知槲皮素、山柰酚、甘草酮A、柚皮素、甲素可能为核心化合物靶点。研究表明，槲皮素是一种有多种活性的多酚类黄酮物质，具有抗心律失常、抗氧化、抗血小板聚集、抗病毒等作用，被广泛应用于医药领域[1]。动物实验得出槲皮素具有对大鼠以及豚鼠心律失常模型具有缩短持续时间以及改善心肌细胞氧化代谢的作用，其作用机制可能与降低心肌细胞自律性相关[2]。徐长庆等[3]研究发现槲皮素能通过延长心肌细胞不应期、保护膜上的Na+-K+-ATP酶、阻断外钙内流等起到抗心律失常作用，国外也有报道[4]通过构建大鼠缺血后心脏再灌注模型，进一步证实槲皮素具有抑制心室异位搏动作用。山柰酚与槲皮素作用类似，具有抗氧化、抗炎、保护心肌细胞、抗病毒等，有研究[5]发现山柰酚抗氧化、抗炎作用可能通过NF-κB和PI3K/AKT/GSK3B通路实现，而其心肌细胞保护作用主要是通过对Akt/GSK-3β信号通路调节发挥作用[6]。甘草酮A是甘草中的主要酚类成分具有抗炎、抗氧化和抗癌等活性[7]，有研究证明[8]甘草酮A可以降低核因子蛋白NF-κB信号传导和前列腺素分泌，从而达到降低炎症反应效果。柚皮素是一种二氢黄酮类化合物，广泛存在于水果中。现代研究证明[9]柚皮素具也被证实具有抗保护心肌细胞、心律失常、降血脂、抗氧化及抗动脉粥样硬化等作用，柚皮素主要通过激活c GMP-PKGIα通路抑制氧化应激从而起到保护心脏作用[10]。杨颖等[11]通过对高脂饲养大鼠研究发现，柚皮素不仅可以降低大鼠的TG水平，还可降低主动脉粥样硬化斑块风险。但目前尚无柚皮素与心律失常相关的基础研究，值得在后续深入探索。甲素是一种7-羟基异黄酮类化合物，有研究通过对甲素与豚鼠心肌细胞研究，发现甲素抗心律失常作用机制可能与对钙离子、钠离子[12]的阻断作用相关，同时，甲素可逆转血清中血脂水平[13]，减少内皮细胞损伤，降低动脉粥样硬化风险。分子对接结果显示，槲皮素、山柰酚、甘草酮A、柚皮素、甲素可能通过调控TP53、MAPK3、JUN、MAPK1等对PVCs起到治疗作用，可见甘草-泽泻药对活性成分多具有抗心律失常、保护心肌细胞、抗氧化、抗炎等功能。

根据GO富集分析结果得出甘草-泽泻药对治疗PCVs主要涉及生物过程包含对药物、脂多糖、细菌源分子、金属离子、细胞外刺激的反应。代丽[14]认为不同的心律失常电生理机制可能与细胞对药物反应有关，取决于心肌细胞对药物的反应。内源性脂多糖是心律失常的常见的化学调节因子。动物实验[15]也进一步证明小剂量脂多糖能发挥心肌细胞保护作用，减少心肌细胞再灌注损伤。细菌感染是导致PVCs因素之一。王刚等[16]研究发现肺部感染后，部分患者出现心律失常，其中以PVCs为主，经常规抗心律失常无效果，予调整抗生素后好转。研究[17]发现金属离子可通过干预HERD通道，从而导致心律失常的产生。相关研究[18]通过天然药物牛磺酸与金属镁离子的结合物与对乌头碱诱发大鼠心律失常发现，牛磺酸镁实验组比对照组可推迟大鼠心律失常出现时间。心肌炎、组织缺血、缺氧、物理因素、化学因素等外界刺激均可导致心律失常的产生，其中以PVCs为主。KEGG通路富集分析结果显示甘草-泽泻药对治疗PVCs主要涉及IL-17信号通路、TNF信号通路等。有研究[19]指出TNF信号通路在室性心律失常疾病中起到重要作用，动物研究[20]表明大鼠急性梗死后TNF通路表达与室性心律失常相关，产生机制可能与细胞内钙增加有关。有研究证实[21]TNF信号通路所介导的炎症反应使心肌膜电位产生变化，从而诱发心律失常。IL-17是种强效促炎因子，能介导多种炎症因子的分泌，与室性心律失常发生密切相关。动物实验证明[22]，给正常家兔注射IL-17后对诱导心肌纤维化和心室重塑起到关键作用，可增加室性心律失常的风险。郝瑞等[23]通过动物实验证明大鼠心律失常发生的概率与体内IL-17水平相关。同时， IL-17信号通道与TNF信号通道具有协同作用，进一步增加室性心律失常风险，其发生机制可能与离子通道电流的变化有关[24]。

分子对接结果显示，核心化合物成分与核心疾病靶点所编码的蛋白结合能均小于-7kcal/mol，二者结合稳定，可形成氢键、疏水作用以及π堆积作用。说明核心化合物能与核心靶点所编码的蛋白结合有效。

综上所述，甘草-泽泻药对治疗PVCs具有“多成分、多靶点、多通路”特点。其槲皮素、山柰酚、甘草酮A、柚皮素、甲素可能通过调控TP53、MAPK3、JUN、MAPK1等靶点干预IL-17信号通路、TNF信号通路等，从而对PVCs起到治疗作用。本研究为甘草-泽泻药对的临床应用提供一定的理论基础，但网络药理学以及分子对接技术存在一定局限性，尚有待进一步通过相关实验加以验证。

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作者简介：姓名：岑崇民，出生年：（1995-），性别：男，民族：壮族，籍贯：广西百色，单位全称：广西中医药大学第一附属医院，职称：住院医师，学位：学士学位，研究方向：老年病防治研究