基于LC-MS代谢组学技术研究慢性持续低氧对SD大鼠肝脏代谢特征的影响

摘要：对正常大鼠及在慢性持续低氧条件下大鼠的肝脏代谢物进行超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术检测，观察低氧诱导环境下大鼠肝脏代谢的影响，寻找差异代谢物及相关代谢通路，探究慢性持续低氧对SD大鼠肝脏代谢发挥作用的机制及具有何种作用。

关键词：LC-MS  代谢组学  慢性持续低氧  肝脏代谢

【中图分类号】R285.5             【文献标识码】A             【文章编号】2107-2306（2021）09--01

前言

随着青藏高原在经济、文化、军事等方面得到极大地发展，同时由于其占有十分重要的生态地位以及战略地位，越来越多的人不断涌入高原，投入相关的生产建设当中。然而氧气不足、低气压是高原环境的特点，长时间生活在平原的人步入高原后通常会出现神经、消化、呼吸等各系统的应激反应。其中，高原缺氧导致肝脏损伤就是高原地区特有的肝功异常原因之一[1]。

1.实验内容

运用高效液相色谱-质谱联用技术检测正常大鼠和慢性持续低氧大鼠肝脏代谢物，寻找差异代谢物及相关代谢通路，探讨慢性持续低氧大鼠肝脏代谢特征的影响。

2.实验方法

使用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术，对正常大鼠与低氧环境大鼠两种不同情况下试验动物的肝脏代谢物进行检测[2-3]，低氧大鼠采用5000m，7000m不同海拔分别培养7天，14天，21天，寻找差异代谢物及相关代谢通路，探讨低氧环境对大鼠肝脏代谢特征的影响。

3.仪器和试剂

（1）主要试剂

甲醇、甲酸、水、乙腈均购自CNW公司，L-2-氯苯丙氨酸购自上海恒创生物科技有限公司。所有化学药品和溶剂均为分析纯或色谱级[4]。

（2）主要仪器

全自动样品快速研磨仪（JXFSTPRP-24/32[5]，上海净信实业发展有限公司），超声波清洗机[6]（F-060SD，深圳福洋科技集团有限公司），台式高速冷冻离心机（TGL-16MS[7-8]，上海卢湘仪离心机仪器有限公司），冷冻浓缩离心干燥器（LNG-T98[9]，太仓市华美生化仪器厂），高分辨质谱仪（QE plus，赛默飞世尔科技公司），高效液相色谱仪（Dionex U3000 UHPLC，赛默飞世尔科技公司），色谱柱（ACQUITY UPLC HSS T3 （100 mm×2.1 mm， 1.8 um），Waters）。数据分析：将 GC-MS 的原始数据经 ChemStation 分析软件转换为 CDF 格式，导入 ChromaTOF 4.34 软件进行预处理，并使用 Fiehn 数据库对代谢物进行定性、峰对齐，导出 CSV 格式的三维数据矩阵，将数据矩阵中的数值进行 log2 转换后导入 SIMCA 14.0 软件进行多维分析。通过 MBROLE 通路分析功能，差异代谢物 [ 变量权重值（VIP）>1 或 P<0.01] 根据数据库 KEGG（http：//www.genome.jp/KEGG/pathway.html）进行代谢途径的通路分析，获得其代谢通路的富集结果。

4.结果

4.1测定获得的物质峰以及代谢物数量如下表所示

4.3代谢通路富集：（1）逆行内源性大麻素信号（2）卵巢类固醇生成（3）皮质醇合成与分泌（4）库欣综合征（5）维生素消化吸收（6）醛固酮合成与分泌（7）胆固醇代谢（8）谷氨酸能突触（9）可卡因成瘾（10）GABA能突触（11）长期抑郁（12）苯丙胺成瘾（13）酒精成瘾（14）磷脂酶 D 信号通路（15）坏死性凋亡（16）癌症中的胆碱代谢（17）鞘脂信号通路（18）碳水化合物消化吸收（19）ABC转运体（20）催产素信号通路（21）甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢（22）癌症中的中心碳代谢（23）产热代谢（24）初级胆汁酸生物合成（25） FoxO信号通路（26）可卡因作用途径（27）血管平滑肌收缩信号通路（28）蛋白质消化吸收（29）胰岛素抵抗（30）利什曼病（31）光转导（32）脂肪细胞中脂解的调节（33）肾素分泌（34）帕金森综合症路径（35）基底细胞癌路径（36）硫代谢（37）半胱氨酸和蛋氨酸的代谢（38）吗啡成瘾路径（39）AMPK信号通路

5.结论

（1）持续低氧处理使大鼠肝脏脂肪和氨基酸代谢分解加快，同时造成肝脏损伤。

（2）雄激素表达过量，生殖系统反应钝化。

（3）新陈代谢的稳态造成了破坏，诱导出一系列代谢并发症，同时患病性风险增加。

（4）出现了一定的神经肌无力。

（5）维生素消化和吸收的改变，影响了体内部分的催化反应。

（6）胆固醇代谢异常，导致内分泌失调和心血管疾病风险增加。

（7）长时间的低氧环境压迫使大鼠产生了一定程度的长期抑郁。

（8）坏死性凋亡的发生，可能诱导多种疾病的发病机制，包括但不限于神经系统疾病，视网膜疾病，急性肾损伤，炎症性疾病和微生物感染。

（9）异常胆碱代谢的发生标志着肿瘤发生的机率增高。

（10）胰岛素抵抗发生，能够证实发生了肥胖症，非酒精性脂肪肝以及心血管疾病等疾病，对生命健康造成威胁。

（11）出现神经退行性运动障碍。

参考文献：

[1]谢本维，孟繁平.青藏高原缺氧环境与肝脏损伤[J].医药前沿， 2012（33）：149-150.

[2]马天成， 孙宇， 马玉坤，等. UPLC-Q-TOF/MS法分析岩大戟内酯B在大鼠体内的代谢产物[J]. 中国药房， 2019， 030（020）：2796-2801.

[3]李元. 不同急性肝损伤模型大鼠卵圆细胞生物学差异及自噬的变化[D]. 河北医科大学， 2013.

[4]张益焘. 发酵豆粕对仔猪大肠菌群碳，氮代谢的影响及其机理[D]. 华南农业大学， 2017.

[5]王宏远、王薇、杨树青、窦丽鑫、刘利军. 多孔氮氧生物玻璃骨修复支架的制备及性能[J]. 中国组织工程研究， 2021， v.25;No.945（16）：67-73.

[6]张益焘. 发酵豆粕对仔猪大肠菌群碳，氮代谢的影响及其机理[D]. 华南农业大学， 2017.

[7]么瑞娜. 玫烟色棒束孢cDNA文库的构建及与小菜蛾Serpin基因的互作因子筛选[D]. 華南农业大学， 2017.

[8]陈荣华. 三七中13种农药残留分析方法及其加工过程残留迁移规律[D]. 广西大学， 2017.

[9]王璞.以CD146为靶点的胃癌早期诊断多功能纳米探针的相关研究[D]. 第三军医大学， 2015.

作者简介：魏杰锋（1995—），男，汉，青海西宁，籍贯河南安阳，研究生，研究方向：动物生理，单位：青海师范大学，单位所在省市：青海西宁，单位邮编810000