来凤凤菊茎叶多糖的脱色纯化工艺研究

郭嘉鹏，罗微，章慧，刘梁，赵玲，刘华英，陈新*

（1.武汉轻工大学 生命科学与技术学院，湖北武汉 430023；2.湖北来凤腾升香料化工公司，湖北恩施 445000）

来凤凤菊（Dendranthema indicumvar.aromaticum）为菊科菊属植物，民间常用于感冒、咽喉肿痛和目赤肿痛等疾病的治疗。其花、茎、叶中化学成分丰富，多为挥发油、黄酮、萜等脂溶性成分，抗氧化、抗菌、抗炎等药理活性显著。近年来，众多学者对来凤凤菊的挥发油、黄酮类等成分进行了相关研究[1]。

现代药理研究表明，植物多糖毒副作用小、无耐药性，具有多种生物活性，主要包括促进免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗炎及抗衰老等[2]，但目前有关来凤凤菊茎叶多糖的研究报道还甚少。

植物多糖色素往往影响其结构和生物活性的研究，也不利于进一步的产业化应用，有关植物多糖脱色纯化方法的研究已有不少报道[3-6]。植物多糖的脱色纯化方法主要有活性炭法[7]、双氧水法[8]、树脂吸附法[9-10]、离子交换法[11]等。目前，植物多糖的脱色和纯化研究主要集中在药用真菌方面，而关于来凤凤菊茎叶多糖脱色和纯化的研究还鲜见报道。本文利用不同色谱材料对来凤凤菊茎叶多糖进行脱色和纯化研究，以便为来凤凤菊茎叶多糖的应用基础研究和产业化开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

来凤凤菊，产自湖北省恩施州来凤县。

1.1.2 仪器及试剂

AUWl20D分析天平，日本岛津；PerkinElmer Lambda 950紫外可见分光光度计，PERKINELMER公司；HPD-100、D101、AB-8、HPD-400、ADS-7、DM130树脂，山东优索化工科技有限公司；Buchi R-210旋转蒸发仪，瑞士Buchi公司；DEAE-52纤维素，上海源叶生物；化学试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 来凤凤菊茎叶多糖制备

将粉碎的来凤凤菊茎叶，以料液比1∶40（g∶mL）的比例加入蒸馏水，超声提取60 min，加入无水乙醇沉淀多糖，最终醇沉浓度为70%，置入冰箱过夜，抽滤后以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤脱水，30 ℃真空干燥，得到来凤凤菊茎叶粗多糖。

1.2.2 来凤凤菊茎叶多糖脱色评价指标

取来凤凤菊茎叶粗多糖，加蒸馏水溶解配制成1 mg/mL的来凤凤菊茎叶多糖溶液，分别通过树脂和纤维素等填料进行柱层析，于450 nm处测吸光度计算脱色率，苯酚-硫酸法于490 nm处检测并计算多糖含量。

脱色率按照式（1）计算：

式（1）中：OD1为脱色前吸光度，OD2为脱色后吸光度。

多糖保留率按照式（2）计算：

式（2）中：M前为脱色前多糖总量，M后为脱色后的多糖总量。

1.2.3 树脂材料筛选

HPD-100、HPD-400、D101、DM130、AB-8、ADS-7、DEAE-52纤维素7种材料分别称取1.0 g，置于具塞锥形瓶中，分别加入1.0 mg/mL的来凤凤菊茎叶多糖样品溶液15 mL，恒温33 ℃，180 r/min振荡，吸附18 h。离心，取上清液，分别计算脱色率和多糖保留率，确定最佳脱色树脂材料。

1.2.4 DEAE-52纤维素层析纯化效果研究

（1）DEAE-52离子交换柱的处理。①DEAE-52（Cl-）纤维素：蒸馏水浸泡溶胀，加水除去悬浮颗粒；0.5 mol/L的NaOH浸泡1 h，水洗，再以0.5 mol/L的HCl浸泡1 h，水洗，使DEAE-纤维素转换为Cl-型，再用蒸馏水进行装柱。②DEAE-52（OH-）纤维素：按①项操作至0.5 mol/L的NaOH浸泡1 h，使DEAE-纤维素转换为OH-型，水洗，再用蒸馏水进行装柱。③DEAE-52（HCO3-）纤维素：按①项操作，最后以0.5 mol/L的NaHCO3浸泡1 h，使DEAE-纤维素转换为HCO3-型，水洗，再用蒸馏水进行装柱。

（2）DEAE-52离子交换柱分离层析。取来凤凤菊茎叶粗多糖溶解，配制成粗多糖水溶液，用不同离子型DEAE-52纤维素柱层析分离，用蒸馏水和NaCl溶液（0.05 mol/L、0.20 mol/L、0.50 mol/L）梯度洗脱。分别在280 nm、450 nm和490 nm跟踪检测洗脱液中多糖、色素和蛋白含量，绘制曲线，确定最佳分离方法。

2 结果与分析

2.1 树脂材料选择

来凤凤菊茎叶多糖色素含量较高，会影响多糖在后期使用中的效果。图1表明，7种树脂对来凤凤菊茎叶多糖色素的吸附率有较大差异。离子交换型的DEAE-52纤维素脱色效果要优于其他6种极性、非极性树脂，其脱色率可达91.84%；同时多糖保留率相对较高，可达91.66%。

图1 不同树脂静态脱色情况图

综上所述，优选DEAE-52纤维素为来凤凤菊茎叶多糖脱色纯化的最优树脂，进行后面的层析纯化效果实验。

2.2 DEAE-52纤维素层析纯化效果比较

2.2.1 DEAE-52（OH-）纤维素纯化结果

从图2（a）可看出，蒸馏水和NaCl溶液梯度洗脱OH-型DEAE-52纤维素层析柱，得到了4个较明显的洗脱峰，这4个洗脱峰所占的比例不同，其中中性多糖集中于第1个洗脱峰，峰高最高；第2、3个洗脱峰较小，表示糖含量较少；第4个洗脱峰主要为色素和蛋白。实验表明，OH-型DEAE-52纤维素层析柱对来凤凤菊茎叶多糖组分的分离有一定效果，但峰形较差，分离度较低。

2.2.2 DEAE-52（Cl-）纤维素纯化结果

从图2（b）可看出，分别用蒸馏水和NaCl溶液梯度洗脱Cl-型的DEAE-52纤维素层析柱，得到了5个较明显的洗脱峰，各洗脱峰峰形集中，且分离度较好，说明Cl-型DEAE-52层析柱分离效果优于OH-型，虽然第1个洗脱峰多糖含量高，但有一个明显肩峰，对称性不好，分离度有待进一步提升。

2.2.3 DEAE-52（HCO3-）纤维素纯化结果

从图2（c）可看出，分别用蒸馏水和NaCl溶液梯度洗脱HCO3-型的DEAE-52纤维素层析柱，得到了7个较明显的洗脱峰，第1个洗脱峰（蒸馏水段）最大，糖含量高；各峰分离度、峰形均优于Cl-型和OH-型的DEAE-52纤维素，分辨率较高；色素和蛋白主要在第6、7峰。实验证明HCO3-型DEAE-52纤维素对来凤凤菊茎叶多糖具有更好的纯化效果。

3 结论与讨论

图2 DEAE-52纤维素层析洗脱曲线图

树脂吸附去除色素和杂质，是一种目前广泛应用的现代分离手段，不同树脂的脱色机理不同，因此，对性质不同的纯化对象需要选择不同类型的树脂。本试验结果表明，离子交换型的DEAE-52纤维素去除来凤凤菊茎叶多糖色素效果最好，而极性和非极性树脂脱色效果较差，DEAE-52纤维素是一种适合来凤凤菊茎叶多糖纯化的树脂。

树脂的离子类型对分离纯化的效果影响十分显著：OH-型的DEAE-52纤维素的分离效果最差，因为OH-离子交换能力过强，选择性较弱；Cl-型离子交换能力较弱，呈中性，不能影响酸性多糖的电荷，选择能力一般；HCO3-型离子交换能力较强，呈碱性，影响酸性多糖的电荷，分离效果最好，分辨率最高，峰形好，洗脱峰数最多。对来凤凤菊茎叶多糖纯化效果依次为DEAE-52（HCO3-）＞ DEAE-52（Cl-）＞DEAE-52（OH-）。

综上所述，DEAE-52纤维素对来凤凤菊茎叶多糖具有较好的脱色效果和较低的多糖损失率，脱色率可达91.84%，多糖保留率可达91.66%；HCO-3型DEAE-52纤维素层析具有较好的分离纯化效果，在工业化生产高品质植物多糖方面有着广阔的应用前景。