岩藻多糖硫酸基检测方法的建立

李萍萍，陈一鸣，颜士茹，张瑞卿，张海毅*，都红芳

（1.威海职业学院 康养学院，山东威海 264200；2.威海人生药业有限公司，山东威海 264200）

岩藻多糖，也称岩藻多糖硫酸酯，主要来源于褐藻，是一类含有岩藻糖和硫酸基团的多糖。岩藻多糖具有多种生物学功能，如抗凝血、抗肿瘤、抗血栓、抗病毒、抗氧化和增强机体免疫机能等，目前对岩藻多糖的研究已经成为研究天然海洋药物和特殊医用食品的热点和主攻方向[1]。360 Market Updates市场数据显示，全球岩藻多糖市场规模将从2018年的3 000万美元增至2025年的3 800万美元，预测期间（2019—2025年）的年复合增长率为3.4%，有望被开发成为21世纪的新药品及保健品原料。褐藻是威海市大量产出的特色海产品，以岩藻多糖作为原料开发的特医食品或药品具有明显的市场竞争优势，将会取得显著的社会和经济效益，并有利于促进威海市海洋生物及制品创新型集群的转型升级和发展，增加该集群在全球海洋产业中的竞争力和影响力。

通过对天然岩藻多糖及半合成岩藻多糖的研究发现，多糖羟基的硫酸酯化是决定岩藻多糖生物活性的重要因素，因为羟基的硫酸酯化，不仅增加了多糖的溶解性，更为重要的是改变了多糖的构象，因此岩藻多糖硫酸基含量的高低，直接体现岩藻多糖功效的好坏[2]。

硫酸根的测定方法主要有比浊法和重量法，但是这些传统方法操作冗杂，需要多种化学试剂，杂质干扰大，灵敏度、重复性和准确度都不理想。岩藻多糖水产行业标准《岩藻多糖》（SC/T 3404—2012）[3]中规定了岩藻多糖硫酸基的检测方法，该方法属于重量法，适用于水产行业岩藻多糖硫酸基检测。而本研究涉及的岩藻多糖主要作为原料药进行研究，有必要依据《中国药典》建立新的硫酸基检测方法。研究表明，采用离子色谱法检测多糖硫酸基含量，操作简单，只需一步灰化操作，灵敏度和准确度都较高[4-10]。

本研究采用灰化法处理岩藻多糖样品，采用离子色谱法测定原料药中硫酸基的含量，并参照《中国药典》四部“9101分析方法验证指导原则”中的相关规定进行方法学验证[11]，为岩藻多糖原料药质量标准的建立提供硫酸根检测实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂及物料

硫酸钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；碳酸钠，色谱纯，北京迈瑞达科技有限公司；岩藻多糖原料药，批号分别为A-2017H-1、A-2017H-2、A-2017H-3，威海人生药业有限公司；Dionex IonPacTM AS9-HC阴离子色谱柱，赛默飞世尔科技公司。

1.2 实验仪器

离子色谱系统，青岛普仁仪器有限公司；FA2004B电子分析天平，江苏迅迪仪器科技有限公司；LK-MA高温马弗炉，洛阳高新开发区格利斯实验电炉厂。

1.3 实验方法

1.3.1 供试品灰化

准确称取供试品1.0000 g，按照《中国药典》四部通则230[11]规定的方法进行灰化并计算灰分含量。

1.3.2 色谱条件及系统适应性试验

阴离子色谱柱；以9 mmol/L碳酸钠为淋洗液，柱温30 ℃；流速为0.8 mL/min；电导检测器；进样量20 μL，定量环进样。以硫酸钠为系统适用性溶液，两针进样计算理论板数、分离度及拖尾因子。

1.3.3 对照品溶液的制备

取105 ℃烘干的硫酸钠约1.2700 g，加少量水溶解，溶液转移至1 000 mL量瓶中，摇匀，作为对照品溶液。

1.3.4 标准曲线的制备

精密吸取对照品溶液2.0 mL、5.0 mL、10.0 mL、20.0 mL，置于100 mL量瓶中，分别加水稀释至刻度，摇匀，用0.22 μm的滤膜过滤，取续滤液，即得标准溶液。取上述标准溶液20 μL注入色谱仪，记录色谱图，以硫酸根离子的峰面积为纵坐标，以对照品标准溶液硫酸基质量浓度为横坐标，回归计算标准曲线。

1.3.5 样品处理及检测

取1.3.1遗留的残渣约20 mg，精密称定，加水溶解，滤过，滤液转移至100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，用0.22 μm的滤膜过滤，取续滤液20 μL注入色谱仪，同法测定，从标准曲线上读出供试品溶液中相当于硫酸基的含量。

1.3.6 精密度试验

取硫酸根离子对照品溶液（50 mg/L），连续进样6次。

1.3.7 重复性试验

取批号为A-2017H-2的岩藻多糖供试品，平行制备6份供试品溶液，进样测定。

1.3.8 加标回收率试验

取批号为A-2017H-2的岩藻多糖供试品灰分约10 mg，精密称定，用水溶解并定容至100 mL容量瓶中，摇匀。用该方法的测定条件检测硫酸基本底值，并进行50%、100%、150%加标回收试验，每个处理3个平行重复。

1.3.9 供试品测定

取批号为A-2017H-1、A-2017H-2、A-2017H-3的岩藻多糖供试品照1.3.5项下方法进行测定。

2 结果与分析

2.1 系统适用性试验

以硫酸钠（50 mg/L）为系统适用性溶液，两针进样计算理论板数（按硫酸根离子峰计算）、分离度及拖尾因子,结果见表1。其中，分离度远大于1.5，可以看出氯离子和硫酸根离子得到了很好的分离（图1），完全消除了重量法中氯离子的干扰。根据系统适用性试验结果，确定采用该方法测定岩藻多糖硫酸基含量的系统相关参数，硫酸基理论板数按硫酸根离子峰计算应不低于5 000，硫酸根离子峰与相邻峰间分离度大于1.5，拖尾因子在0.95～1.25。

表1 系统适用性试验结果

图1 硫酸根离子色谱图

2.2 精密度试验

取硫酸根离子对照品溶液（50 mg/L），连续进样6次，结果见表2。由表2数据计算可得，峰面积测量值的相对标准偏差RSD为0.7%，保留时间RSD为0.01%，表明仪器精密度良好。

表2 精密度试验结果

2.3 线性关系试验

硫酸根离子在0～200 mg/L浓度范围内与峰面积呈现良好的线性关系，结果见图2。线性方程为y=76 926x+107 499（n=5），相关系数R2=0.9999。

图2 硫酸根标准曲线

2.4 重复性试验

取批号为A-2017H-2的岩藻多糖供试品，平行制备6份供试品溶液，进样测定,结果见表3。由表3数据计算可得，供试品溶液平均硫酸根离子含量为14.8%，RSD为1.8%，表明该方法重复性良好。

表3 重复性试验结果

2.5 加标回收率试验

加标回收率试验结果见表4。加标回收率均在96%～101%范围内，平均回收率为98.8%，RSD值为1.7%，表明该方法准确度较高。

表4 加标回收率试验结果

2.6 供试品测定

取3批岩藻多糖原料药供试品进行硫酸基含量测定，结果见表5。每批供试品测定相对偏差均小于5%，样品测定结果稳定。

表5 供试品含量测定结果

3 结论

本文采用灰化法处理岩藻多糖样品，采用离子色谱法测定原料药中硫酸基的含量，以《中国药典》为依据建立方法，并进行方法学验证。该方法可以快速有效地检测岩藻多糖供试品中硫酸基含量，无干扰，结果稳定，准确度和精密度良好，是一种测定岩藻多糖硫酸基含量的理想方法。

与岩藻多糖水产行业标准SC/T 3404—2012规定的重量法相比，本研究采用的离子色谱法有效消除了氯离子的干扰，而且可以对氯离子进行定量分析。同时，该方法不需要加入任何化学试剂，经济环保，只需一步灰化操作，简单可行，大大缩短检验时间，提高检测效率。通过将样品灰化后进行检测消除了有机物对硫酸根离子检测的干扰，拓宽了检测方法的应用范围。该方法已成功应用于岩藻多糖原料药硫酸基的检测，为岩藻多糖原料药质量标准的建立提供参考，为当前岩藻多糖市场上的产品提供质量控制依据。