超滤液用量对C群脑膜炎奈瑟球菌精制多糖质量的影响

买学宏，宋泽玉，赵友晨，刘钰，冯佳丽

（兰州生物制品研究所有限责任公司菌苗一室 甘肃省疫苗工程技术研究中心，甘肃兰州 730046）

作为重要的有机化工基础原料，苯酚在石油精炼、皮革制造、树脂合成、香料生产等行业广泛应用，是一种难降解的有机物，即使低浓度也会造成环境污染及人类健康危害[1-2]。在制药行业，A群、C群脑膜炎奈瑟球菌精制多糖的制备过程中也通常采用苯酚法抽提去除细菌蛋白质，再通过超滤的方法去除苯酚残留[3]。

超滤是一种膜分离过程，利用膜表面孔径机械筛分作用，在压力作用下截留溶液中相对分子质量较高的物质，而小分子的溶质透过膜的分离过程[4-5]。超滤技术的优点是操作简便，成本低廉，尤其是超滤技术的实验条件温和，不会引起温度和pH的变化，可以防止生物大分子的降解[6]。苯酚及其化合物是一种有中等毒性的物质。低浓度的苯酚可深入内部组织，侵犯神经中枢，刺激脊髓，最终导致全身中毒；而高浓度的苯酚进入人体，会引起急性中毒，甚至造成昏迷和死亡。因此，在中国药典中对于苯酚残留量有严格的规定。

本研究通过对C群脑膜炎奈瑟球菌多糖苯酚法去蛋白后的多糖液进行超滤，研究不同的超滤液用量对C群脑膜炎奈瑟球菌精制多糖苯酚残留量和对多糖分子量、回收率、细菌内毒素和精糖收率的影响。以期为超滤在多糖精制中的运用提供借鉴依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

氯化钙、硫代硫酸钠、溴酸钾、溴化钾、盐酸、碘化钾、无水碳酸钠、淀粉等，均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器

Pellicon型超滤器，美国MILLIPORE；AKTA purifier10型层析系统，美国Cytiva；BET-72M型细菌内毒素检测仪，天津天大天发仪器设备有限公司。

1.3 多糖液的超滤

1.3.1 氯化钙溶液的配制

氯化钙溶液（4 mol/L）配制：称取4 440 g无水氯化钙加水10 L溶解。使用前，将4 mol/L氯化钙溶液稀释至0.5 mol/L。

1.3.2 超滤方法

使用灭菌注射用水对超滤器和管道进行预冲洗。确定膜包已完全润湿，检测膜包的完整性及水通量（NWP）。进液管和截留管放入多糖液中，透过液管放入废液桶。开始超滤，不断调节泵速保持进口压力不大于20 psi，待多糖液浓缩至少量时，加入5 L超滤液，继续超滤。待多糖液浓缩至少量时再次加入5 L超滤液。重复上述步骤，总计加入50 L超滤液。在超滤液用量达到20 L、30 L、40 L和50 L时，分别从截留管处取5 mL多糖液检测苯酚的残留量。

用相同的超滤方法超滤20批粗制多糖，其中10批在超滤液用量达到20 L时收获精制多糖，剩余10批在超滤液用量达到50 L时收获精制多糖。检测多糖分子量、多糖回收率、细菌内毒素等指标。

1.4 苯酚残留量检测方法

1.4.1 苯酚残留量测定

用移液器量取供试样品1 mL，置具塞锥形瓶中，加去离子水50 mL，加入0.02 mol/L溴溶液15 mL，沿瓶壁加入6 mol/L盐酸溶液10 mL，摇匀，密塞，避光放置30 min后，稍启瓶塞，加25%碘化钾溶液2 mL于瓶颈，使流下，密塞，摇匀。以少量去离子水洗瓶颈，用0.02 mol/L硫代硫酸钠滴定液滴定至近终点时，加淀粉指示液约0.5 mL，滴定至蓝色消失。试验设置空白对照，用1 mL去离子水代替供试样品[7]。

1.4.2 苯酚残留量的计算

苯酚残留量的计算公式为：

式（1）中：V0为空白试验消耗硫代硫酸钠滴定液的体积，mL；V1为供试样品消耗硫代硫酸钠滴定液的体积，mL；C为硫代硫酸钠滴定液的浓度，mol/L；15.69为苯酚相对分子质量的1/6；1.0为供试样品取样量，mL。

1.5 分子量检测

取供试品1 mL，加至已标定的色谱柱中，用0.2 mol/L的氯化钠洗脱，流速为0.35 mL/min，检测波长为206 nm，通过分析206 nm的保留时间（第二峰保留时间）得出精制多糖的分子量及回收率。

1.6 细菌内毒素检测

将样品稀释成无干扰的浓度，加入内毒素测定仪专用试管，立即放入反应器中开始检测。待最后一个浓度点的反应曲线超过限值后，停止检测，计算数据，得出样品的细菌内毒素值。

2 结果与分析

2.1 超滤液用量对苯酚残留量的影响

连续对6批C群脑膜炎奈瑟球菌多糖粗制品进行超滤精制，每批对超滤液用量达到20 L、30 L、40 L和50 L时的多糖液进行取样并检测其苯酚残留量，检测结果见表1。

表1 超滤液用量对苯酚残留量的影响（单位：g/L）

对表1的实验结果进行统计整理得图1。由图1可知，随超滤液用量从20 L增加至50 L，精制多糖中的苯酚残留量从0.01283 g/L降至0 g/L。经单因素方差分析（ANOVA）发现，超滤液用量的改变对精制多糖苯酚残留量的影响为极显著水平。经组间多重比较分析可知，超滤液用量20 L与40 L、50 L之间存在显著性差异；30 L与50 L之间存在显著性差异。

图1 随超滤液用量增加苯酚残留量的变化趋势

2.2 超滤液用量对精制多糖的影响

用20 L超滤液和50 L超滤液各纯化10批粗制多糖，收获精制多糖后对其多糖分子量、多糖回收率、细菌内毒素和收率等指标进行检测，检测结果见表2。

表2 超滤液用量对精制多糖的影响

利用配对t检验研究超滤液用量对各生产指标的影响[8-9]。从表3可以看出，除内毒素指标外，其余4组指标之间均有显著差异（p＜0.05），其中超滤液20 L处理的多糖分子量和回收率显著高于50 L处理组；而50 L超滤液处理后，苯酚残留量显著降低，精糖收率则显著提高。

表3 超滤液用量对多糖影响的t检验结果

配对t检验显示各生产指标在超滤量为20 L和50 L时呈现出显著性差异（p＜0.05），因此使用效应量（Effect size）研究差异幅度情况。使用Cohen'sd值表示效应量大小，Cohen's d值越大说明差异越大，效应量小、中、大的区分临界点分别是0.20、0.50和0.80[8-9]。从表3的Cohen'sd值可以得出：除内毒素之外，50 L超滤处理组在多糖分子量、多糖回收率、苯酚残留量和精糖收率4个生产指标与20 L超滤处理组均体现出大效应量。

3 讨论与结论

以往在C群脑膜炎奈瑟球菌精制多糖纯化过程中，超滤液用量为20 L的0.5 mol/L氯化钙溶液，纯化后精多糖的苯酚残留量控制在可接受水平。但随着《中国药典 三部》（2020版）的颁布，对于苯酚残留量的规定更为严格（不高于6.0 mg/g）。

本次试验表明，超滤液用量的改变对多糖液中苯酚残留量有显著性影响。当超滤液用量达到50 L时，多糖液中的苯酚残留量降为0 g/L，获得的精制多糖分子量升高；精制多糖收率略有升高，说明增大超滤液的使用量不会对精制多糖造成损失。综合分析，当超滤液使用量为50 L时，完全消除了苯酚残留对精制多糖质量影响，同时多糖分子量增大且不影响精制多糖收率，对提升产品质量及保障生产的平稳运行是大有裨益的。