党参水提物对D-半乳糖致衰老小鼠肺组织自噬蛋白BNIP3表达的影响

康甲超，蒙洁，陈冬梅，王勇，吴萍民，王晶

(甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000)

衰老是人体必经的一个自然过程，其不仅在组织器官，而且在细胞水平也可引起机体功能的变化，大量研究表明衰老与细胞自噬密切相关[1-2]。细胞自噬是机体为了适应不同环境而做出的有效内部调节，适度的自噬可以有效延缓衰老、改善衰老相关疾病[3]；然而，自噬是一个降解过程，过度的自噬对机体有害，任何过度的自噬都可能导致细胞死亡[4-5]。党参Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.具有益气补中，延缓衰老的功效[6]，并且有研究发现党参可以抑制脑组织细胞自噬水平以减轻脑缺血再灌注损伤[7]。前期课题组研究发现党参对衰老肺组织具有保护作用，研究中通过对各组肺组织基因芯片分析，发现基因Bnip3在肺组织衰老后和高剂量党参干预后均发生差异改变[8]。BNIP3是一种仅有BH3的自噬蛋白，既能诱导细胞自噬，又能诱导细胞死亡[9]。为了进一步了解自噬蛋白BNIP3对衰老肺组织的作用以及党参的干预功效，本实验采用D-半乳糖复制小鼠衰老模型，通过检测各组小鼠肺组织中自噬蛋白BNIP3和基因Bnip3的表达量，以期发现党参对衰老肺组织在自噬方面的保护机制。

1 材料

1.1 动物

SPF级昆明种小鼠100只，雌雄各半，2月龄，体质量(18±2)g，甘肃中医药大学科研实验动物中心提供，动物合格证号SCXK(甘)2015-0002。饲养于甘肃中医药大学SPF级动物房，室温20～25 ℃，自然光照，摄食和自由饮水。所有实验程序和方案均按照甘肃中医药大学动物伦理委员会(编号：2017-106)的指导方针执行。

1.2 药物

党参，采自甘肃岷县，经甘肃中医药大学中药资源教研室杜弢教授鉴定为白条党参。取党参100 g，分2次煎煮，第1次加10倍量水煎煮1 h，第2次加6倍量水煎煮1 h，合并2次提取液，过滤，浓缩成含原药材0.5 g/mL的水煎剂，置4 ℃冰箱保存，党参水提物每5 d制备1次。

1.3 主要试剂

D-半乳糖购于美国Sigma公司，批号：24895207，临用前用生理盐水配制成12 g/L备用；引物均由Invitrogen公司提供；Trizol试剂购于Invitrogen公司，货号15596-026；SYBR荧光染液购于美国应用生物系统公司，货号4367659；快速定量RT试剂盒购于中国天根生化科技有限公司，货号KR106-02；兔抗BNIP3抗体(1∶150)购于中国索莱宝公司，货号K004134p；兔SP试剂盒(兔链霉卵白素-生物素法检测系统)购于中杉金桥，货号SP9001-6；DAB显色试剂盒购于中杉金桥，货号ZL1-9018-3。

1.4 主要仪器

透射电子显微镜JEM-1230，购于日本捷欧路科贸有限公司；离心机5415D，购于德国艾本德公司；PCR7500系统，购于美国应用生物系统公司；凝胶成像系统UVP I-D001，购于博奥生物集团有限公司；光学显微镜，购于日本奥林巴斯公司。

2 方法

2.1 分组

将100只SPF级昆明种小鼠随机分为正常对照组、模型组和党参低、中、高剂量组，每组20只，雌雄各半。

2.2 造模及给药

依照龚国清等人的造模方法造模[10]，采用颈背部皮下注射D-半乳糖溶液复制衰老模型，给药剂量为每日每只小鼠50 g/L D-半乳糖溶液，注射量为0.025 mL/g。造模的同时党参低、中、高剂量组给予5、10、15 g/kg党参溶液灌胃，灌胃体积为每日每只小鼠0.025 mL/g，正常对照组和衰老模型组给予等量生理盐水灌胃，以上造模连续42 d。

2.3 透射电子显微镜

于末次给药2 h后，用10%水合氯醛麻醉动物，颈椎脱臼法处死小鼠，分别将取得的正常对照组、模型组和党参低、中、高剂量组小鼠肺组织冲洗干燥后切成约1～3 mm/片，然后将其放入预先冷却的2.5%戊二醛溶液中，在4 ℃下固定过夜，用PBS冲洗3次，1%锇酸染色，脱水，浸泡，包埋，聚合后将肺切成70 nm片状，重新染色后观察正常对照组、模型组和高剂量党参组肺组织细胞超微结构的变化。

2.4 RT-PCR方法

采用Trizol试剂提取正常对照组、模型组和高剂量党参组总RNA，mRNA定量检测采用SYBR荧光染料法进行。采用两端不同的引物进行逆转录，经逆转后cDNA模板在上下游引物引发下进行定量PCR检测，mRNA表达量均以GAPDH为内参基因，数据采用2-△△CT方法计算基因相对表达量。见表1。

表1 RT-PCR检测Bnip3引物序列

2.5 免疫组织化学染色

于末次给药2 h后，用10%水合氯醛麻醉动物，注射量为0.004 mL/g，颈椎脱臼法处死小鼠，分别将取得的正常对照组、模型组和党参低、中、高剂量组小鼠肺组织固定，制作成蜡块。二甲苯脱蜡12～15 min，3%的过氧化氢浸泡10 min除去内源性过氧化氢酶，封闭血清后滴加一抗、二抗、显色剂。

2.6 统计学处理

3 结果

3.1 肺组织超微结构观察

正常对照组Ⅱ型肺泡上皮细胞结构正常，线粒体结构正常；模型组中大量线粒体肿胀，膜结构消失，线粒体结构破坏，Ⅱ型肺泡上皮细胞中的板层小体完全脱落；高剂量党参组中未见异常改变，肺泡腔、板层小体和线粒体无明显改变(见图1)。

3.2 反转录聚合酶链反应(RT-PCR)

设计两种不同引物检测肺组织中基因Bnip3表达量，使用引物一检测Bnip3相对表达量发现，Bnip3在衰老后肺组织中表达上调，在高剂量党参干预后表达下调(见表2、图2A)，使用引物二检测Bnip3相对表达量发现，Bnip3在衰老后肺组织中表达上调，在高剂量党参干预后表达下调(见表2、图2B)差异具有统计学意义(P<0.01)。

3.3 免疫组织化学染色

图像分析采用Image J软件，分析各组小鼠肺组织免疫组织化学染色在高倍镜下三个视野的BNIP3阳性率，结果用均数±标准差表示，与正常对照组相比，模型组BNIP3阳性率明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，高剂量党参组BNIP3阳性率明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)(表3)。正常对照组中阳性细胞少见，低剂量党参组阳性细胞多见，中剂量党参组中阳性细胞少量，高剂量党参组中阳性细胞少见，模型组阳性细胞多见，阳性率最高，染色结果最深(见图3)。

注：图中△所指为板层小体，→所指为肿胀破坏的线粒体。图1 肺组织透射电镜观察

表2 RT-PCR不同引物序列检测Bnip3相对表达量

注：A,Bnip3表达量(引物一);B,Bnip3表达量(引物二);与正常对照组比较，**P<0.01；与模型组比较,##P<0.01。图2 RT-PCR方法检测衰老后及高剂量党参干预后肺组织中Bnip3相对表达量

注：图中→所指为阳性细胞。图3 各组小鼠肺组织免疫组化结果(×400)

表3 党参水提物对D-半乳糖致衰老小鼠肺组织中蛋白BNIP3表达的影响

4 讨论

细胞自噬是一把双刃剑，研究显示，肺组织细胞的过低自噬和过度自噬均可引起或加重肺损伤[11]。在本次研究中，模型组肺组织超微结构发生明显异常改变，细胞结构被破坏，细胞膜受损，大量胞质外流，线粒体肿胀破坏；高剂量党参干预后肺组织超微结构好转，未见明显异常。BNIP3定位于线粒体外膜，在细胞缺氧环境下其表达量明显增多[12]，对凋亡和线粒体自噬至关重要[13]。BNIP3在细胞死亡和存活中的作用已被广泛研究[14]，诱导BNIP3过表达可通过线粒体功能障碍促进大多数细胞类型的死亡[15]，2005年Lemasters[16]首次提出线粒体自噬的概念，主要指在氧化应激、衰老及能量限制等刺激下，细胞内的线粒体发生去极化损伤使线粒体被破坏。通过对模型组和高剂量党参组超微结构的观察，发现党参具有保护衰老肺组织和肺细胞中线粒体的作用，其机制可能与党参阻止细胞过度自噬有关。

研究表明BNIP3基因敲除导致细胞凋亡减少，而BNIP3基因过度表达则增加了凋亡细胞的数量[17]。本研究通过RT-PCR方法检测小鼠衰老后和高剂量党参干预后肺组织中Bnip3表达量，发现衰老后肺组织中Bnip3表达量明显升高，高剂量党参干预后明显降低；通过免疫化学染色技术，观察各组肺组织中BNIP3阳性率的变化，模型组中BNIP3阳性率最高，高剂量党参组中BNIP3阳性率明显下降，与RT-PCR结果一致，再次证明党参能降低衰老肺组织中BNIP3的表达量，保护衰老肺细胞因BNIP3基因过度表达免受凋亡。

综上所述，党参能改善衰老小鼠肺组织的超微结构，保护肺细胞中线粒体免受破坏，党参对衰老小鼠肺组织的保护作用可能是通过降低BNIP3的过度表达有关。本研究为党参对细胞自噬影响的药用开发提供了一定的理论依据。