电针联合膈下逐瘀汤对输卵管炎性不孕大鼠TLR4、NF-κB水平的影响

胡喜姣，李红梅，杨东霞，李兰，孙萌，刘丽

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001；3.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

不孕症指女性无避孕，性生活至少12个月而未孕。近年来，不孕症发病率逐年上升并趋于年轻化，输卵管性病因占不孕症首要因素[1]。输卵管炎性不孕是指因输卵管管腔阻塞、拾卵及蠕动异常等输卵管结构与功能的损伤引起的妊娠障碍。中医学认为，“瘀”为本病主要病机，治疗药物应以活血化瘀为主[2]。膈下逐瘀汤为气滞血瘀证的代表方剂，源于清代王清任《医林改错》。吾师刘丽教授根据多年临床经验，治疗输卵管性不孕症，在此方基础上加减运用，疗效确切[3]。

“一针二灸三吃药”，电针治疗输卵管炎性不孕症取得良好疗效。已有临床研究表明，针刺关元、大赫、三阴交、次髎、秩边穴位，能够降低输卵管肿瘤坏死因子-α和血清白细胞介素-6水平[4]。课题组前期临床研究表明，针药联合治疗有利于提高输卵管炎性不孕症患者输卵管复通率及受孕率[5]。本研究在此基础上，设立电针联合中药治疗组，与单纯中药治疗组相比较，重点突出电针及针药联合治疗输卵管炎性不孕症的机制及价值，支持临床推广应用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

健康SPF级SD大鼠48只，雌性，周龄8～10周，体质量(200±20)g，购自黑龙江中医药大学实验动物中心，合格证编号：SCXK(黑)2019-007。环境温度保持在22 ℃，相对湿度维持40%，光暗周期12 h，分笼饲养于黑龙江中医药大学实验动物中心，适应性饲养1周。

1.1.2 主要药物及试剂

膈下逐瘀汤(GD)：当归、川芎、桃仁、五灵脂、丹皮、赤芍、乌药、延胡索、甘草、香附、红花、枳壳(以上中草药均购于黑龙江中医药大学附属第二医院饮片药局)；金黄色葡萄球菌(北京东方赛瑞生物技术有限公司，ATCC29213)；Toll样受体4(TLR4)兔多克隆抗体(武汉三鹰生物，19811-1-AP)；核因子-κBp65(NF-κBp65)兔抗鼠多克隆杭体(武汉三鹰生物，10745-1-AP)；氯化钠注射液(吉林省都邦药业股份有限公司)；水合氯醛、乌拉坦(上海山浦化工有限公司)；二甲苯(天津市永大化学试剂有限公司)；无水乙醇(天津市永大化学试剂有限公司)。

1.2 分组及造模方法

1.2.1 分组方法

48只雌性SD大鼠，随机分为4组，每组12只，分别为正常组、模型组、治疗组、对照组。正常组不给予任何手术操作及药物；模型组行金黄色葡萄球菌输卵管局部注射造模后，给予等体积蒸馏水；治疗组同等方法造模后，给予电针及中药治疗；对照组同等方法造模后，给予单纯中药治疗。

1.2.2 造模方法

将10%水合氯醛按照0.4 mL/100 g剂量对大鼠进行腹腔注射麻醉，待麻醉显效后，取俯卧位，大鼠背部两侧肾区先行备皮，碘伏消毒，铺无菌巾，取肋缘过肾区近脊柱侧约0.5 cm，行长约1 cm横切口，逐层打开腹腔，充分暴露单侧子宫及输卵管、卵巢，向输卵管—卵巢方向注入4×109/mL金黄色葡萄球菌悬液0.1 mL，注菌过程中防止菌液逆流并避免机械性损伤，术毕逐层关腹，碘伏再次消毒切口。同种方法处理对侧输卵管。

1.3 药品制备及干预方法

1.3.1 膈下逐瘀汤制备方法

当归9 g，川芎6 g，桃仁9 g，五灵脂6 g(包煎)，牡丹皮6 g，赤芍6 g，乌药6 g，延胡索3 g，甘草9 g，香附5 g，红花9 g，枳壳5 g以上饮片，五灵脂纱布包好，按比例水煎煮，一煎10倍量水，二煎8倍量水，加热回流提取各2 h，合并两煎药液，水煎液浓缩适当浓度移至蒸发皿中，最后移至真空干燥箱中干燥至衡重，得膈下逐瘀水煎液干粉。

1.3.2 干预方法

经输卵管注射金黄色葡萄球菌，可在术后第28 d形成输卵管炎性不孕症模型[6]。故于实验第29 d开始给药，治疗组给予电针及膈下逐瘀汤口服。首先将大鼠固定鼠套中，参照《实验针灸学》选穴：三阴交、关元、足三里。局部消毒后，直刺进针，深度为2～7 mm，得气后，针柄接电针仪，电流强度1 mA，连续波频率2 Hz，强度保持肌肉微振为宜，留针20 min，每日1次。并于每日9时给予膈下逐瘀汤水煎液浓缩干粉，加水制成相当于0.36 g/mL的混悬液。对照组大鼠每日9时给予等同浓度的膈下逐瘀汤混悬液，灌胃剂量按照2 mL·100 g-1鼠重给药。模型组给予等体积蒸馏水，连续治疗4周。正常组不给药。

1.4 检测方法

1.4.1 肉眼观察输卵管形态及评分

给药第29 d，各组大鼠腹腔麻醉(方法同前)后，无菌条件下解剖大鼠，充分暴露输卵管，肉眼观察大鼠输卵管病变情况，注意有无扭曲、积水及与周围组织粘连等情况，具体评分标准详见表1。

表1 输卵管组织形态评分标准

1.4.2 光镜观察输卵管病理学情况

将大鼠输卵管组织制成3 μm厚度的切片，进行HE染色，制成病理切片，光镜下观察各组大鼠输卵管形态学改变情况。

1.4.3 免疫组化检测输卵管TLR4及NF-κB表达

将各组大鼠输卵管行免疫组化检测，取新鲜组织固定于4%多聚甲醛24 h后。修整目的部位组织，对应标签置于脱水盒。经脱水、包埋后切片,按4 μm切片,取石蜡切片进行苏木素染色，返蓝。脱水后中性树胶封片，显微镜观察图像。

免疫组化图像分析：采用平均光密度值，在光密度值基础上计算平均光密度值，即指整个视野中第一点的光密度叠加点数的总和，公式：OD=∑A/N。光密度值根据光吸收定量换算而来：A=Log[I0(x,y)/I(x,y)]=K(x,y)C(x,y)L(x,y)(A代表吸光度，I0代表出射光强度，I代表入射光强度，K代表吸光系数，C和L代表被测物浓度和厚度(S,Y)代表素点位置)。

1.5 统计学方法

2 实验结果

2.1 肉眼观察针药联合对大鼠输卵管组织形态评分影响

正常组大鼠输卵管均呈粉红色，外观表面光滑，输卵管管腔内无积水、无积脓，与周围组织无明显粘连。与正常组比较，模型组大鼠输卵管均出现不同程度的输卵管管壁增厚、肿胀及盆腔粘连情况；与模型组相比，治疗组与对照组大鼠输卵管管壁增厚、肿胀及盆腔粘连例数均有所减少，程度有所减轻，均能不同程度改善输卵管形态及盆腔粘连情况。与对照组相比，治疗组作用更为明显。见表2。

表2 肉眼观察各组大鼠输卵管形态情况(n=12)

各组大鼠输卵管形态评分情况，与正常组相比，模型组总分升高极为显著(P<0.01)；与模型组相比，治疗组与对照组总分下降显著(P<0.05)；与对照组相比，治疗组总分下降显著(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠输卵管形态评分情况

2.2 HE染色观察针药联合对大鼠输卵管病理学影响

与正常组相比，模型组大鼠输卵管细胞排列较紊乱，胞体肿胀，大部分细胞核肿胀，细胞粘连充血；治疗组输卵管管腔上皮轻度脱落，输卵管周围可见少量炎细胞；对照组输卵管管腔大量炎细胞，上皮细胞脱落，部分坏死，输卵管周围可见较多炎细胞，胞体肿胀明显。见图1。

图1 各组大鼠输卵管HE染色情况(×400)

2.3 针药联合对大鼠输卵管TLR4和NF-κB蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组TLR4和NF-κB水平有十分显著的上升(P<0.01)，表明慢性输卵管炎症模型的构建成功；与模型组比较，治疗组可使TLR4和NF-κB含量出现明显下调(P<0.05)；对照组可使TLR4含量下调，对NF-κB含量影响并不明显；与对照组相比，治疗组在下调TLR4和NF-κB水平上作用更加明显。见表4，图2～3。

表4 各组大鼠输卵管中TLR4和NF-κB表达情况

图2 各组大鼠输卵管TLR4表达情况(×400)

图3 各组大鼠输卵管NF-κB表达情况(×400)

3 讨论

不孕症一直以来是困扰育龄夫妇的难题，中医药对于不孕症的治疗有独特的优势。电针具有改善人体循环，促进炎症吸收，活血化瘀功效。关元，位于大鼠脐下约25 mm处。《千金要方》中记载:“妇人绝嗣不生……灸关元三十壮，报之”，关元为阴中之阳，可治妇人不孕。有研究表明，关元具有抑制微炎症作用[7]。足三里(后三里)，位于大鼠膝关节后外侧，在腓骨下头约5 mm处。具有补益精血之功，为强壮保健要穴。正所谓“正气存内，邪不可干”，故本研究选用此穴，提高疗效。三阴交，后肢内踝尖直上10 mm处。三阴交为足三阴经交会穴，与胞宫关系密切，是治疗妇科病要穴，电针三阴交可活血调经、通调气血，通过改善子宫微循环、加快子宫血流而起到镇痛作用[8]。

膈下逐瘀汤中枳壳、香附、延胡索、乌药行气活血止痛，红花、桃仁、赤芍、五灵脂、丹皮活血祛瘀止痛；川芎、当归活血养血调经；甘草调和诸药。全方共奏行气活血、祛瘀行滞之功。现代药理研究表明，枳壳、香附中含有挥发油、黄酮类成分，具有抗菌抗病毒、抗炎功效[9-10]；延胡索、乌药均具有镇痛、抗炎、抗菌功效[11-12]；红花为传统的活血化瘀药，常与桃仁配伍，桃仁中的桃仁蛋白能够明显抑制炎症引起的血管通透性，具有抗炎作用[13]。牡丹皮中的丹皮酚能够杀金葡菌[14]，调节NF-κB水平[15]。当归补血活血为“妇科要药”[16]，具有显著抗炎功效[17]。川芎为“血中之气药”，与当归配伍行气活血，利于化瘀疏通。甘草应用广泛，有“十方九草”之称，有研究表明，甘草具有较强的抗炎功效[18]。

Toll样受体4(TLR4)信号通路是重要的炎性通路之一。TLR4在正常输卵管中表达强度较低，在输卵管炎的发生中起着重要作用，表达强度较高[19]。FazeliA等[20]证实TLR4与生殖系统的免疫有关。核转录因子(NF-κB)是诱导单核巨噬细胞产生炎症细胞因子的重要转录因子[21]。当输卵管黏膜受到病原微生物的反复或大量入侵时，机体的固有免疫机制被激活，TLR4在识别病原相关分子模式后，引发级联反应，使单核巨噬细胞产生大量的促炎细胞因子，通过其细胞毒作用及促炎因子间的协同作用，导致输卵管炎的发生和输卵管黏膜上皮细胞的破坏。

本研究表明，电针联合膈下逐瘀汤能够明显改善输卵管炎性不孕大鼠的输卵管形态，下调TLR4及NF-κB的表达水平，效果优于单纯膈下逐瘀汤治疗。电针疏通经络，改善微循环；膈下逐瘀汤行气活血，化瘀通络；二者联合应用，体现从“瘀”论治不孕症，疗效显著。目前临床上，气滞血瘀型不孕症为常见分型，治疗中亦多采用针药联合治疗，本实验结果支持临床推广应用。