miRNA-122-5p对细胞色素 P450 3A4调控替格瑞洛代谢细胞学研究

才 艺， 赵晓杰， 张效林， 刘 丹， 田孝祥， 闫承慧

北部战区总医院 心血管内科，辽宁 沈阳 110016

替格瑞洛是我国当前使用较为普遍的抗血小板药物[1-2]，主要经细胞色素 P450 3A4(cytochrome P450 3A4，CYP3A4)代谢，少部分经CYP3A5代谢，其主要代谢产物为AR-C124910XX。体外实验表明，活性代谢产物具有活性，可与血小板P2Y12ADP 受体结合，达到抗血小板作用，活性代谢物的全身暴露量约为替格瑞洛的30%～40%[3-6]。细胞色素P450具有表型多态性与基因多态性的特点，是造成个体药物代谢差异性的主要原因，其中,CYP3A4参与多种药物的代谢过程[7-8]。CYP3A4的表达主要取决于其细胞中微小RNA(microRNA,miRNA)的水平。有研究证实，miR-122-5p在肝组织中大量表达,可作为丙型肝炎病毒相关肝细胞癌的诊断生物标志物，用于诊断肝细胞癌症等作用[9-13]。miR-122-5p对CYP3A4表达具有特异性调控[14-15]，但miR-122-5p对CYP3A4的调控是否与替格瑞洛的代谢存在相关性尚待证实。本研究旨在探讨miRNA-122-5p 是否通过特异性调控CYP3A4的表达，从而影响替格瑞洛的代谢。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞培养和刺激 人正常肝细胞(human normal liver cell，LO2)维持在补充有10% FBS 的 DMEM中，温度为37℃，湿度为5% CO2。采用Lipofectamine RNAiMAX试剂(Invitrogen,Carlsbad，CA)，按照制造商方案将miRNA模拟物(100 nmol/L)、miRNA抑制剂(100 nmol/L)及其对照转染到LO2中。转染后36 h，收集LO2。在miR-122-5p模拟物和miR-122-5p抑制剂转染后，LO2用5 μmol/L替格瑞洛刺激24 h。

1.2 蛋白质印迹法 在转染和处理后，收集6孔板中的细胞，并在冰上用蛋白裂解液制备全细胞裂解物。蛋白质浓度用二喹啉甲酸蛋白检测试剂盒(Boster)测定。全细胞蛋白质(20 μg)在SDS-PAGE上分离并电泳转移到聚偏二氟乙烯膜上。膜与选择性兔抗人CYP3A4多克隆抗体孵育，随后用二抗孵育。使用化学发光试剂使条带在暗室处曝光可视化。利用Imag J对条带进行灰度分析。

1.3 RNA提取 使用TRIzol试剂提取总RNA。使用逆转录试剂盒和特定的逆转录引物(RiboBio)将总 RNA(2 μg)逆转录为 cDNA。使用 KAPA SYBR®FAST qPCR 试剂盒(Kapa Biosystems，Wilmington，USA)和特异性引物(RiboBio)在 7900HT 快速实时PCR系统(Applied Biosystems)上进行定量PCR。U6 miRNA用作miR-122-5p的内标，GAPDH用作CYP3A4的内标。每个反应重复3次，分析采用 2-ΔΔCt法。

1.4 液质联用检测培养基中替格瑞洛及其代谢物AR-C124910XX含量 准确量取培养基200 μl，加入300 μl三氯甲烷-水溶液(2∶1)和200 μl乙腈，加入10 μl(500 ng/ml替格瑞洛-d7)内标液，涡旋混匀，以12 000 r/min离心10 min，取上清液500 μl至35℃的氮气流下干燥，将每个残留物重新溶解在 50 μl乙腈-水(1∶1)中，以12 000 r/min离心20 min，取上清液进行UPLC-MS/MS检测。色谱条件：色谱柱UPLC HSS C18柱(50.0 mm×2.1 mm，1.7 μm)，柱温40℃，流动相：0.2%甲酸的水溶液(A)和乙腈(B)组成，流速设置为0.25 ml/min。正离子模式下的多反应监测。参数如下：ESI正电离模式，锥孔电压为40.0 V，毛细管电压为3.2 kV，去溶剂化温度为450℃，离子源温度为100℃。去溶剂化、锥孔气体(氮气)的流速分别为600、50 L/h。用于定量的离子对为替格瑞洛m/z 523.19～m/z 127.10，内标替格瑞洛-d7 m/z 530.23～m/z 127.1；AR-C124910XX m/z 479.18～m/z 153.06。

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件对数据进行处理。采用Pearson 法进行相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-122-5p模拟物和抑制剂转染后改变LO2中miR-122-5p表达 在体外培养的LO2中分别转染miR-122-5p模拟物和抑制剂后，通过实时聚合酶链反应检测miR-122-5p的表达情况。结果证实，与miR-122-5p模拟物阴性对照组相比较，miR-122-5p模拟物组转染后显著增加LO2中miR-122-5p表达(P<0.05)。与miR-122-5p抑制剂阴性对照组相比较，miR-122-5p抑制剂组显著下调了LO2中miR-122-5p表达(P<0.05)。见图1。

图1 不同转染组miR-122-5p的mRNA水平

2.2 miR-122-5p调控LO2中CYP3A4的蛋白表达 miR-122-5p 模拟物和抑制剂转染后，检测LO2中CYP3A4的蛋白表达情况。Western Blot和定量分析证实，与miR-122-5p模拟物阴性对照组相比，miR-122-5p模拟物组CYP3A4的表达显著降低(P<0.05)。与miR-122-5p抑制剂阴性对照组相比，miR-122-5p抑制剂组CYP3A4的表达显著增加(P<0.05)。见图2。

图2 不同转染组CYP3A4的蛋白表达水平(a.CYP3A4与GAPDH的代表性蛋白质印迹图像；b.CYP3A4/GAPDH灰度值定量分析)

2.3 miR-122-5p下调LO2中CYP3A4的mRNA表达 在转录水平上，与miR-122-5p模拟物阴性对照组相比，miR-122-5p模拟物组CYP3A4的表达显著降低(P<0.05)。与miR-122-5p抑制剂阴性对照组相比，miR-122-5p抑制剂组CYP3A4的表达显著增加(P<0.05)。见图3。

图3 不同转染组CYP3A4的mRNA水平

2.4 miR-122-5p调控CYP3A4的表达影响替格瑞洛的浓度 与miR-122-5p模拟物阴性对照组相比，miR-122-5p模拟物组中细胞培养基中替格瑞洛浓度增高，其活性代谢物AR-C124910XX的浓度显著降低(P<0.05)。与miR-122-5p抑制剂阴性对照组相比，miR-122-5p抑制剂组中细胞培养基中替格瑞洛浓度降低，其活性代谢物AR-C124910XX的浓度显著增加(P<0.05)。见图4。

图4 不同转染组细胞培养基中替格瑞洛及其活性代谢物AR-C124910XX的浓度(a.不同转染组细胞培养基中替格瑞洛的浓度；b.不同转染组细胞培养基中活性代谢物AR-C124910XX的浓度)

2.5 miR-122-5p-CYP3A4表达变化与替格瑞洛的代谢相关性 以CYP3A4相对蛋白表达为因变量，替格瑞洛及其活性代谢物AR-C124910XX的浓度为自变量进行Pearson相关性分析，结果表明，替格瑞洛的浓度与CYP3A4的相对蛋白表达呈负相关(r=-0.888，P<0.05)，活性代谢物AR-C124910XX与CYP3A4的相对蛋白表达呈正相关(r=0.727，P<0.05)。替格瑞洛及活性代谢物AR-C124910XX浓度与CYP3A4相对蛋白表达的散点图见图5。

图5 CYP3A4/GAPDH表达与替格瑞洛及其活性代谢物AR-C124910XX浓度相关性散点图(a.CYP3A4/GAPDH表达与替格瑞洛浓度相关性散点图；b.CYP3A4/GAPDH表达与活性代谢物AR-C124910XX浓度相关性散点图)

3 讨论

本研究采用LO2进行转染实验，应用实时聚合酶链反应技术检测转染后细胞中miR-122-5p水平，结果表明，miR-122-5p的模拟物和抑制剂能够改变LO2中miR-122-5p水平。本研究应用蛋白印记技术和实时聚合酶链反应技术检测转染后LO2中CYP3A4的蛋白表达和转录水平，结果表明，miR-122-5p在蛋白表达和转录水平上抑制CYP3A4的表达。对转染后的LO2加替格瑞洛(5 μmol/L)刺激24 h，利用高效液相质谱联用技术检测细胞培养基中替格瑞洛及其代谢物AR-C124910XX的浓度，结果表明，与miR-122-5p模拟物阴性对照组比较，细胞培养基中替格瑞洛的浓度升高，活性代谢物AR-C124910XX降低；与miR-122-5p抑制剂阴性对照组比较，细胞培养基中替格瑞洛的浓度降低，活性代谢物AR-C124910XX的浓度升高。本研究采用Pearson相关性分析检验miR-122-5p-CYP3A4表达变化与替格瑞洛的代谢相关性，结果表明，细胞培养基中替格瑞洛的浓度与CYP3A4表达呈负相关，活性代谢物AR-C124910XX与CYP3A4表达呈正相关。miR-122-5p通过调控CYP3A4的表达进而影响替格瑞洛的代谢。

CYP3A4的基因多态性是对药物代谢影响的重要原因。Gill等[14]应用萤光素酶报告基因分析证实了miR-122-5p与CYP1A2和CYP3A4的3′UTR之间的相互作用，miR-122-5p在细胞中的过表达对CYP3A4具有抑制作用。Holmberg等[16]研究结果表明，CYP3A4*22等位基因显著降低替格瑞洛的消除，从而增强其抗血小板作用。CYP3A4的特异性表达与替格瑞洛的代谢具有相关性。本研究存在一定的局限性，由于研究时间短，未收集服用替格瑞洛的急性冠状动脉综合征患者的血浆样本，对血浆中的miR-122-5p进行分析，没有结合临床患者用药后的药物代谢情况，具体机制还需进一步大样本及随访研究验证。

综上所述，miR-122-5p通过调控CYP3A4的表达进而影响替格瑞洛的代谢。替格瑞洛是治疗急性冠状动脉综合征的重要药物，深入探讨药物代谢的影响对临床合理用药和疾病发展的研究提供了研究基础。