趋化因子CCL21基因 rs2812377单核苷酸多态位点与急性心肌梗死发病相关性分析

张文旭， 姜金萍， 程茗慧， 张效林

北部战区总医院 心血管内科，辽宁 沈阳 110016

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是一种常见、多发的心血管疾病，发病率及病死率较高，是常见的心血管疾病死亡原因之一[1-2]。有研究发现，炎症在AMI后继发的心肌组织损伤中发挥重要作用。冠状动脉粥样硬化的斑块组织破裂，继发斑块核心区域脂质大量释放入血，激活血液中血小板和凝血因子，罪犯血管的血栓组织形成。在此过程中，炎症继发的细胞因子、趋化因子在病灶区域的活化和聚集引起病灶部位的炎症级联放大效应中发挥重要作用，导致病灶部位心肌组织缺血、坏死[3-4]。趋化因子作为一种小分子量蛋白质，可以引起炎症的级联放大效应，加剧动脉粥样硬化的进展及心肌梗死后心肌细胞的变性、坏死，趋化中性粒细胞等炎症细胞到达病变部位，通过炎症反应造成病变部位损伤[5]。经典的趋化因子可以分为C、CC、CXC和CX3C四个家族。CCL21作为趋化因子CC家族的重要成员，在动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞、平滑肌细胞和内皮细胞中大量表达。同时，CCL21能够趋化单核细胞和内皮细胞的粘附效应，加剧动脉粥样硬化不稳定斑块炎症反应进程[6-7]。目前，CCL21与AMI发病的相关性研究少见报道。本研究旨在探讨AMI患者血清中CCL21的表达水平，以及CCL21基因rs2812377单核苷酸多态位点与AMI发病的相关性。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取自2012年4月至2018年10月北部战区总医院心血管内科收治的253例AMI患者纳入B组。纳入标准：年龄45～75岁者；24 h内出现过急性胸痛症状者；诊断符合美国心脏病学学会/美国心脏协会标准关于AMI标准者；入院后血清心肌酶谱出现动态演变者；典型胸痛症状持续时间>30 min者；入院后心电图呈动态演变，心电图至少有两个肢体导联ST段抬高≥0.1 mV，或胸前导联ST段抬高0.2 mV，或有新发生的左束支传导阻滞者。另选取211例同期住院且冠状动脉造影显示冠状动脉的狭窄程度≤20%者纳入A组。本研究经医院伦理委员会审批。所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 研究方法 记录所有研究对象年龄、性别、体质量、高血压、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯、吸烟等一般资料。记录患者的血清生化指标及心肌酶学动态变化情况，以及AMI患者的心电图的动态演变情况。清晨采集研究对象空腹外周静脉血5 ml，EDTA-Na2进行抗凝，-20℃冰箱储存。

1.3 酶联免疫吸附法 酶联免疫吸附实验检测血清中CCL21浓度。绘制标准曲线，将待检测的血浆标本原液或者稀释1倍的稀释液加入待检测的反应板孔内，室温25℃反应1 h后洗涤反应检测板，每个孔内加入100 μl HRP标记的抗CCL21抗体工作液，室温25℃放置检测板1 h，洗板，加入100 μl显色，25℃ 20 min孵育后，加入终止液体，450 nm单波长检测待检孔的吸光度值，计算待检测样品的浓度。

1.4 DNA提取 将5 ml EDTA抗凝血倒入15 ml尖头离心管中，3 000 r/min、4℃离心10 min，将收集的血液上清分离，-80℃低温冰箱冻存。在收集上清后的尖头离心管中加入红细胞裂解液10 ml，冰上裂解15 min，3 000 r/min、4℃离心10 min。加入50 μl蛋白酶K(10 mg/ml)和10% SDS 0.5 ml室温消化，反复离心、洗涤后挑出DNA沉淀，去除RNA酶，室温溶解。

1.5 基因分型 采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱仪，通过iPLEX化学分析对CCL21基因rs2812377单核苷酸多态位点的基因分型进行分析。该分析方法遵循标准的Sequenom程序，CCL21基因型的分析由北京博淼生物科学技术有限公司完成。

2 结果

2.1 两组研究对象一般资料比较 两组研究对象年龄、男性比例比较，差异无统计学意义(P>0.05)。B组高血压比例、吸烟比例、体质量指数、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇高于A组，高密度脂蛋白胆固醇低于A组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组研究对象一般资料比较

2.2 两组研究对象基因型分析 CCL21基因rs2812377单核苷酸多态位点3种基因型TT型、GT型、GG型在A组和B组中的分布频率分别为47例(22.3%)、92例(43.6%)、72例(34.1%)和37例(14.6%)、115例(43.9%)、101例(41.5%)。CCL21基因rs2812377单核苷酸多态位点T、G等位基因在A组和B组中的分布频率分别为186例(44.1%)、236例(55.9%)和185例(36.6%)、321例(63.4%)。两组基因型TT型、GT型、GG型分布频率和等位基因T、G分布频率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。CCL21基因rs2812377单核苷酸多态位点G等位基因是AMI发病的独立危险因素(比值比=1.36，95%可信区间1.05～1.77，P<0.05)。

2.3 两组研究对象血浆CCL21表达水平比较 B组血浆中CCL21水平为(889.78±268.98)pg/ml，明显高于A组的(516.52±186.01)pg/ml，差异有统计学意义(P<0.05)。B组GG型、GT型、TT型血浆CCL21表达水平均高于A组，差异有统计学意义(P<0.05)。两组GG型、GT型血浆CCL21表达水平均高于TT型，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组研究对象血浆CCL21表达水平比较

3 讨论

AMI在冠状动脉粥样硬化病变的基础上发生。粥样硬化斑块内部的炎症负荷、脂质负荷超过粥样硬化斑块纤维帽的承载能力，粥样硬化的薄纤维帽破裂，粥样硬化斑块释放炎症介质及脂质成分，激活机体血液中的血小板及纤维蛋白原等发生凝血瀑布效应，最终导致罪犯血管的血栓形成，造成罪犯血管病变部位的心肌组织缺血、坏死。有研究表明，炎症在AMI发生过程中发挥重要的作用[8-9]。

本研究对CCL21基因rs2812377单核苷酸多态位点与AMI的相关性进行分析，结果发现，CCL21基因rs2812377单核苷酸多态位点与AMI相关；进一步分析发现，CCL21 rs2812377不同基因型携带者血浆中CCL21表达水平存在差异，提示CCL21基因rs2812377 G等位基因是AMI的独立危险因素，其发病风险为正常者的1.36倍。CCL21位于人类9号染色体的p13.3，是能够编码110个氨基酸的小分子量蛋白质。CCR7受体是趋化因子CCL21的主要结合受体，其与经典的趋化因子受体结构相似，是具有7次跨膜结构域的G蛋白耦联受体，分子量组成为378个氨基酸。CCR7基因位于17号染色体q12-q21.2区域。趋化因子CCL21通过与CCR7结合引起病变组织炎症级联反应[10]。CCR7主要在胸腺的T细胞和B细胞中表达，在机体的免疫炎症反应调节中发挥重要作用，CCR7通过与其配体CCL21结合，诱导免疫细胞的成熟与分化。动脉粥样硬化的形成是AMI发病的重要病理进程[11-12]。有研究报道，趋化因子CCL21与其受体CCR7结合后，可诱导动脉粥样硬化炎症反应，同时恶化动脉粥样硬化病变的反应过程[13-16]。但另有研究发现，CCL21与CCR7结合后，可以抑制动脉粥样硬化斑块的进程[17]。以上研究结果不一致的原因可能为研究者选择的动脉粥样硬化模型不同[3]，也可能为动物饲养的过程中，饮食、环境、气候的细微差别造成的研究结果不同。

综上所述，CCL21基因rs2812377单核苷酸多态位点与AMI发生相关，CCL21基因 rs2812377可以作为AMI的生物标志物。