东亚飞蝗pSMC重组抗原表达及多克隆抗体制备

王麒霖，邱 佳，余 瑛，夏玉先

(1.重庆理工大学 药学与生物工程学院，重庆 400054；2.重庆大学 生命科学学院，重庆 400030)

染色体结构维持蛋白(structural maintenance of chromosome，SMC)广泛存在于从细菌到人类的生物中，是一类结构高度保守的ATP酶家族成员蛋白。SMC蛋白呈V形结构，有2条长臂，每一长臂末端都有一个ATP结合的头部结构域，其分子结构中包括5种可识别的结构域：NH2-末端核苷三磷酸(NTP)结合结构域、铰链区、2个由铰链分隔的螺旋线圈和一个COOH-末端结构域[1]。

在真核细胞中，目前发现的SMC蛋白有6个(SMC1-6)[2]，这些蛋白质以SMC1与SMC3、SMC2与SMC4、SMC5与SMC6的异二聚体形式与非SMC成员(Kleisin和HEAT亚基)结合行使功能[3]。 SMC与非SMC形成了3种复合物：黏着素(SMC1/3)，对染色单体的黏着起关键作用；凝聚素(SMC2/4)，促进姐妹染色单体的压缩和后期分离；SMC5/6复合物，促进DNA修复并影响未受损细胞的染色体稳定性[4-5]。

SMC的功能绝不仅仅是维持染色体结构的完整性，它很可能还参与了多种基因的表达调控及免疫调节。Smc家族成员(包括Smc2/3/4/5)可促进LPS诱导的IL-6生成，提示Smc家族成员在促进先天免疫中的作用。其中，Smc4是炎症固有反应的积极调节因子。Smc4通过向nemo启动子招募H4K5ac促进NF-κB和IRF3的固有激活，通过表观遗传方式增强nemo的转录，随后诱导促炎性细胞因子和IL的激活[6]。Smc5/6是抑制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)转录的限制因子，当定位于核结构域10(ND10)时抑制HBV转录。HBV通过表达HBV X蛋白(HBx)来对抗这种限制，Smc5/6被降解时，HBV和HBx阴性病毒在PHH细胞中建立高水平感染，而不诱导干扰素或其他细胞因子的产生[7]。

Smc与肿瘤的发生有关。临床病理研究表明：SMC在乳腺癌、结肠癌、肝癌等多种肿瘤组织表达[8-10]，参与了癌细胞增殖、迁移、侵袭过程[11]，但详细的机制仍不清楚。与正常组织相比，肝癌组织中Smc4 mRNA和蛋白高表达。SMC4表达下调则能降低肝癌细胞的增殖[12]。与此类似，在异种移植裸鼠中，SMC2缺失抑制膀胱癌细胞增殖，促进凋亡，减少集落形成，减少肿瘤生长。SMC2的过度表达则恢复TUG1缺失细胞的生长，提示：SMC2是膀胱癌的原癌基因。因此，SMC的抑制或缺失可能对癌症治疗有潜在的意义[13]。此外，染色体结构畸变的诱发也可能与Smc直接相关。SMC蛋白在细胞周期中的重要性可以通过Smc基因在人类癌细胞系中经常发生突变这一事实进一步证实[14]。

近期的文献报道提示：SMC也在一些炎症性疾病中高表达，在T细胞中SMC可能参与了激活TLR和病毒引发的先天性免疫反应[6]。但人们对于SMC在免疫调节中的作用机制仍然知之甚少。本团队最近研究发现了一种SMC在东亚飞蝗血淋巴吞噬细胞中高表达(命名为pSMC)，该SMC在吞噬细胞中的功能和天然免疫中的作用有待研究。

本研究以东亚飞蝗为材料，从其血细胞中克隆了含有SMC保守结构域的pSMC249-383抗原片段，经重组表达、纯化获得了重组抗原，以该重组抗原免疫小鼠获得了多克隆抗体，为下一步进行pSMC相关功能研究奠定了工作基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1试剂

Taq DNA聚合酶、dNTP、EcoR Ⅰ、Hind III、DNA连接酶均购自TaKaRa公司，Ultrapure RNA Kit(DNase I)、HiFiScript cDNA Synthesis Kit购自康为世纪公司，质粒提取试剂盒、DNA快速纯化/回收试剂盒购自OMEGA试剂公司，荧光磁珠购自德国Chemicell公司，其他试剂均为国产分析纯。

蛋白质纯化试剂及配方：细胞裂解液：25 mmol/L NaH2PO4(pH值为8.0)，0.4 mol/L NaCl，0.1%tween20，0.1 mmol/L PMSF。 平衡溶液：25 mmol/L Tris-HCl (pH值为8.0)，0.4 mol/L NaCl，20 mmol/L咪唑。100 mmol/L咪唑洗脱液：25 mmol/L Tris-HCl (pH值为8.0)，0.4 mol/L NaCl，100 mmol/L咪唑。400 mmol/L咪唑洗脱液：25 mmol/L Tris-HCl (pH值为8.0)，0.4 mol/L NaCl，400 mmol/L咪唑。

1.1.2动物、质粒及菌株

东亚飞蝗由重庆大学基因中心提供。BALB/c小鼠购自重庆医科大学动物中心。质粒pET30a(+)、大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)细胞为本实验室保存。

1.1.3pSMC序列

该序列数据来源于东亚飞蝗血淋巴转录组测序结果，具体的氨基酸序列如下：

DGRRPSAPAAASLPRYNSFSSDDEGQREERKT

LPEENGFLTGENSQRQRDKKKPLLEENGFTPADTS

YRQRDNKKPVIEENGFTPADTSYTSGSGSVMGRDV

GPPPPPPPRAASAMSLHLQPPPDKPDRHASTTAPE

EAGLHVSAGELLGRTHEELVLLLIQLRRQSAAVCK

AMETCHMEIEAQARFVELETPKRLEHLKKLEDLK

RHLLDLEKQYEKGKPLVNLVDNMVKLGSLYRGPS

ARERLEFNQKVQEKRLLAEERRDWDRLSPDRTQL

QAKVQQLYRLDRLLQEESSTLQSLQQDKELLERAL

AGLRHKLQNNSHFSPLEVEHFRKQQRALERELSRV

RLLLAHNSKKLEETVAENARLEQELVILRQKLQQPI

TEPGGGTAALEAELRRVQRLVGDLTRQRKQLSLQV

QQLTQQRPGAAGVSSSRGSSSMPSRKRHHSTWLVT

DLDTLETQDLGVETAVSPASSQATTATSPASTLRSP

MYTSREAGGGMEMESEVPPPLPAPPEIPPEYPPPPP

PPPPPSEEALLGPGEQYCPHVDINEADDRMKRFYG

IIPKEKQQEIKTVRIVKRESERRQRDRDRSGNIGIPL

TNGGVSTGKRPSAADESEIANSTSEVQGFQKQQLG

PVEEEVSESSRPFSETLLSASVDDDEEDDDPAIDLQ

FQRSLSLPRGFGKRERLSGAPPPPPIRSASPRGEGM

GTGTNSRQQRVRFKDGDYTSVSSSPSPSPSPSQLSP

VFKSQAARAIVQEVSQSPRKRAVPKEKRRHHTVSS

SKPLLDMESSASRMGSARSRDDLDMERALRPRRIN

APDVVRSTMSHKDFKYNENTIDSILGTPSKIIIPERYI

PEQAPELSAEEQLHRLKKAEAIRKMLSETSAISASE

GIEEEHQTATLKKKVAAEKRQREHLLQLNQLLAR

QQVMEKSKVVAGSTCAPTME

1.2 pSMC基因的生信分析

采用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLASTp进行pSMC序列结构分析，亚细胞定位采用Euk-mPLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/#)分析，抗原表位采用(http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)网站工具进行分析。

1.3 pSMC抗原扩增引物设计

采用Primer Premier5设计引物，序列分别为，F引物：5′-GCAGAATTCCAGAAGGTCCAGGAGAAACG-3′；R引物：5′-CTCAAGCTTTCATGGCTCTGTTATTGGCTGT-3′。

1.4 蝗虫血淋巴总RNA的提取与pSMC基因的扩增

用RNA试剂盒提取东亚飞蝗成虫血淋巴总RNA，按试剂盒说明进行反转录获得cDNA。

pSMC249-383PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 7 min。扩增结束后用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.5 pET30a(+)-pSMC249-383原核表达载体的构建

将得到的PCR产物回收纯化，纯化的PCR产物和pET30a(+)质粒分别用EcoR Ⅰ、Hind III进行双酶切处理。酶切后的PCR产物和pET30a(+)质粒用T4DNA连接酶连接，转化DH5α感受态细胞。用含卡拉霉素的LB转化平板筛选转化子。挑取单克隆进行菌落PCR鉴定、质粒酶切鉴定、DNA测序分析，筛选鉴定pET30a(+)-pSMC249-383重组质粒。

1.6 重组pSMC249-383的原核表达及纯化

将鉴定序列正确的重组质粒，转入大肠杆菌BL21(DE3)中，在37℃下诱导培养，待OD600至0.6～0.8时，加入IPTG(1 mmol/L)诱导表达5 h，SDS-PAGE确定重组蛋白的表达形式，超声破碎法破胞。从1L发酵液中收获菌体，用PBS(含1mmol/L PMSF)10 mL制备菌悬液，超声条件为80 Hz，超声5 s，间隔5 s，总时间30 min。超声至溶液透明，高速离心收集上清液，用Ni-NTA柱对上清液中的目的蛋白进行纯化，SDS-PAGE检测目的蛋白纯度，BCA试剂盒测定蛋白浓度。

1.7 Anti-SMC抗体制备及pSMC的细胞定位

对纯化后的重组pSMC249-383蛋白进行SDS-PAGE电泳，用1 mol/L氯化钾染色，切下含有目的蛋白的胶条，然后用超纯水洗涤脱色，在胶条透明无色后，加入液氮研磨，用PBS重悬，注射BALB/C小鼠腹腔进行免疫，免疫剂量为每只小鼠每次100 ug pSMC249-383蛋白，免疫周期为2周1次，3次免疫后对小鼠进行尾部采血测定血清效价，当效价大于5 000时，收获血清。

pSMC的细胞定位采用免疫荧光法检测。向东亚飞蝗体内注射红色荧光标记的纳米磁珠，3 h后采血，制作血涂片。血涂片于37 ℃干燥1 h，PBS洗5 min，重复3次；用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次；0.3% Triton X-100处理5 min，PBS洗3次；加封闭液(PBS含3%BSA)， 37 ℃，封闭1 h，PBS洗3次；加PBS稀释的血清(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，PBS洗3次；加FITC标记的兔抗鼠二抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗3次；加入10倍稀释后的DAPI处理2 min，PBS洗3次。荧光显微镜观察并拍照，采集图像软件为OLYMPUS CellSens Standard 1.14。

2 结果与分析

2.1 pSMC基因的生物信息学分析

2.1.1结构域分析

在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中对SMC蛋白质结构进行分析。结果(图1)显示：pSMC蛋白由933个氨基酸残基组成，SMC保守结构域主要分布在第200-422区段。

图1 pSMC结构域分析示意图

2.1.2蛋白质的亚细胞定位

对pSMC氨基酸序列进行在线分析(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/#)，结果显示pSMC蛋白定位于细胞质和细胞核。

2.1.3抗原表位分析

在线分析(http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl) pSMC蛋白的抗原表位。

结果(图2)显示：pSMC蛋白在N端50-450肽段的抗原表位最为丰富。本研究选择pSMC的249-383肽段作为pSMC抗原区段进行克隆，将该片段命名为pSMC249-383。

图2 pSMC蛋白抗原表位分析曲线

2.2 蝗虫血淋巴总RNA的提取和pSMC249-383片段的扩增

用RNA提取试剂盒提取蝗虫血淋巴总RNA，琼脂糖凝胶电泳(图3(a))显示RNA条带完整，无降解，且RNA的OD260/OD230值和OD260/OD280值均大于1.8，表明提取的RNA纯度较高，适合作为扩增模板。

将提取的总RNA用反转录试剂盒合成cDNA第一链，以此为模板对pSMC249-383片段进行扩增，电泳检测结果表明扩增产物大小约为405bp(图3(b))，与预期的片段长度符合。

a.蝗虫血淋巴总RNA提取.M:DL2000 DNA marker；1-2:蝗虫血淋巴总RNA;b.pSMC249-383的PCR.M:DL2000 DNA marker；1:pSMC249-383的PCR产物图3 pSMC249-383片段扩增图

2.3 pET30a(+)-pSMC249-383原核表达质粒的构建

扩增的pSMC249-383和pET30a(+)质粒分别用EcoRI和HindIII进行双酶切，然后回收纯化、连接。将连接产物转化DH5α感受态细胞，对转化子进行菌落PCR鉴定，得到阳性菌落的电泳条带大小约405bp(图4(a))。

对菌落PCR鉴定为阳性的克隆进行过夜培养，提取其质粒，用EcoR I和 Hind III酶切处理。结果显示该质粒含有目的条带(图4(b))，为重组质粒。对此重组质粒的DNA测序结果显示：插入片段为pSMC249-383，表明pET30a(+)-pSMC249-383重组表达载体构建成功。

a.转化子的菌落PCR鉴定.M:DL2000 DNA marker；1-2:转化子PCR产物; b.重组质粒pET30a(+)-pSMC249-383的酶切鉴定.M:DL2000 DNA marker；1:EcoR I 和 Hind III 酶切重组pET30a(+)-pSMC249-383；N:DL10000 DNA marker图4 pET30a(+)-pSMC249-383重组质粒鉴定图

2.4 pSMC249-383重组蛋白表达形式分析

将构建成功的pET30a(+)-pSMC249-383重组质粒转化BL21(DE3)，在LB培养基中进行发酵培养，经IPTG诱导后分离发酵液中的菌体。菌体经超声破碎后，分离上清与沉淀，进行SDS-PAGE电泳。电泳结果(图5)显示：pSMC249-383重组蛋白大量存在于裂解上清中，在沉淀中较少。说明pSMC249-383重组蛋白在BL21(DE3)中主要为可溶性表达。用电泳法测定的pSMC249-383重组蛋白分子量大小为21.8KD，与预期一致。

2.5 pSMC249-383重组蛋白的纯化

培养1L pET30a(+)-pSMC249-383/BL21(DE3)发酵液，取诱导培养后菌体的裂解上清，用Ni亲和层析技术[11-12]纯化pSMC249-383重组蛋白，对纯化过程中的洗脱样品用SDS-PAGE电泳进行检测(图6)。

M：蛋白质分子量marker；1：pET30a(+)-pSMC249-383/BL21裂解上清；2：穿柱液；3-4：20mM/L咪唑洗脱液；5-7：100mM/L咪唑洗脱液；8：400mM/L咪唑洗脱液图6 SDS-PAGE检测pSMC249-383蛋白纯化图

结果显示pSMC249-383重组蛋白能较好地被Ni柱吸附，用100 mmol/L咪唑溶液洗去非特异性结合蛋白，再用400 mmol/L咪唑溶液洗脱目的蛋白，可获得纯度较高的重组pSMC249-383蛋白。image J软件分析显示pSMC249-383重组蛋白纯度为80%，浓度为1.98 μg/μL，1 L发酵液可获得纯化后pSMC249-383重组蛋白约20 mg。

2.6 pSMC的抗血清制备与pSMC249-383的亚细胞定位

用SDS-PAGE分离纯化后的pSMC249-383蛋白，切取含有pSMC249-383蛋白条带的胶条，粉碎胶条制成悬液免疫小鼠，ELISA法检测显示获得的pSMC249-383抗血清效价大于1∶64 000。

采用免疫荧光技术检测pSMC在东亚飞蝗血淋巴细胞中的定位。结果(图7)显示：pSMC主要分布于细胞核，且吞噬了红色荧光磁珠的吞噬细胞细胞核中pSMC信号较其他细胞更强，表明pSMC定位于细胞核，在吞噬细胞中高表达。

FITC：FITC标记的羊抗鼠二抗；Magnetic beads：红色荧光标记的纳米磁珠；Merge：红绿通道叠加图7 pSMC在蝗虫血淋巴细胞中的定位分析图

3 多克隆抗体制备

本研究采用原核pET系统成功克隆并表达了pSMC249-383抗原，用该重组表达的抗原免疫小鼠获得了高效价的抗血清。一般来说，制备多克隆抗体比单克隆抗体过程简单，周期更短，多克隆抗体灵敏度更高，但特异性通常不如单克隆抗体好[15]。本研究通过对pSMC的核酸、蛋白序列进行生物信息学分析，选取其抗原表位丰富且特异性较好的区段进行克隆，获得了免疫原性及特异性均较好的重组抗原pSMC249-383。该重组抗原在大肠杆菌中以包含体形式表达，不仅表达量高，且因带有6×His标签纯化方便[16]。为了获得高纯度抗原，本研究对Ni亲和层析纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE电泳，从凝胶中切取含目的蛋白条带的凝胶胶条，用于免疫小鼠。该方法不仅简化了获得高纯度目的蛋白的纯化步骤，而且凝胶在免疫过程中充当了佐剂的作用[17-18]，能有效增强小鼠的免疫应答。本实验使用该方法在3次免疫后SMC多克隆抗体血清效价达1∶64 000，表明该方法便捷且省时高效。

4 结论

对pSMC的序列分析显示，pSMC中含有核定位信号序列；免疫荧光检测结果显示，pSMC在东亚飞蝗血淋巴吞噬细胞高表达，且定位于细胞核。由于吞噬细胞为天然免疫细胞，SMC在DNA复制、基因表达调控中至关重要，pSMC在吞噬细胞中如何维持DNA稳态，影响或调控天然免疫相关过程值得关注。