抑霉乳酸菌脱毒特性及青贮应用的研究

赵雅茹 许庆方 高文俊 郭刚 陈雷 玉柱

（1. 山西农业大学草业学院，晋中 030801；2. 内蒙古正时生态农业有限公司，呼和浩特 010000；3. 山西农业大学动物科学学院，晋中030801；4. 中国农业大学草业科学与技术学院，北京 100193）

青贮饲料产业的壮大促进畜牧业迅速发展和农业结构调整。青贮饲料优点较多，在反刍动物日粮中不可或缺，在畜牧业中有着巨大的发展潜能［1］。青贮饲料乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）分为同型发酵和异型发酵。同型发酵乳酸菌在青贮饲料发酵过程中起促进作用，产生大量乳酸（lactic acid，LA），降低青贮环境pH，阻止营养成分分解［2］。常见的是植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），乳球菌属（Lactococcus）也有利于酸性环境的形成［3］，屎肠球菌（Enterococcus faecium）、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）等也经常被应用［4］。异型发酵LAB主要有布氏乳杆菌（L. buchneri）、短乳杆菌（L. brevis）、肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides），这类LAB产生乙酸（AA），抑制腐败菌生长且影响青贮有氧稳定性［5-6］，研究表明将短乳杆菌添加到青贮饲料中，可以改善饲料的发酵品质，同时提高有氧稳定性［7］。

青贮饲料密封不严或开封使用时霉菌增殖会导致饲料腐败。霉菌通过呼吸作用降解营养物质和有机酸，分解纤维素（cellulose），破坏细胞壁，损坏青贮茎叶结构，使青贮感官品质下降［8］。从青贮饲料中分离出来的主要霉菌有曲霉菌属（Aspergillus）、青霉菌属（Penicillium）、毛霉菌属（Mucor）、镰刀菌属（Fusarium）等［9］，其分泌的二级代谢产物称为霉菌毒素［10］，它会造成饲料霉变、品质降低，严重者使动物中毒死亡［11］，其中危害较大的是黄曲霉毒素B1（AFB1）［12］。

LAB可以显著抑制霉菌生长，并且可以降解生物毒素。研究发现，LAB明显抑制黄曲霉菌菌丝的生长，降解毒素［13］。LAB抑制霉菌生长的机制可能与其分泌的有机酸有关，研究发现，LAB分泌的有机酸可以抑制霉菌生长，减少毒素产生［14］。同时，其分泌的抗真菌成分破坏霉菌菌丝壁，抑制霉菌分生孢子萌发，从而减少毒素积累［15］。

随着我国草牧业的推进，青贮饲料的诸多优势决定了其发展前景广阔。但是霉菌增殖导致青贮饲料腐败，给草牧业和乳制品行业带来巨大损失，且有些霉菌产生毒素，严重危害动物及人类健康。特异性LAB在抑制精饲料发霉变质等方面研究较多，而在青贮饲料抑霉方面的研究较少。通过添加具有分泌抗真菌活性物质的LAB来抑制霉菌生长，吸附毒素，改善青贮饲料品质，提升安全性能，对青贮产业发展具有重要意义。本研究着力于分析LAB对霉菌形态结构破坏及活性物质鉴别，阐明LAB抑霉机制，为优质安全青贮提供高效菌剂。

1 材料与方法

1.1 材料

黄曲霉菌（来自发霉变质的青贮饲料），植物乳杆菌（来自发酵良好的青贮饲料），植物乳杆菌无细胞上清液（CFS），霉菌孢子液（106孢子/mL），磷酸缓冲液（PBS），AFB1标准品，AFB1工作液（5 μg/mL），2020年9月从山西农业大学试验田随机采取的全株玉米样品制成的青贮饲料。

1.2 方法

1.2.1 黄曲霉菌产毒性能分析 将黄曲霉菌送至北京清析技术研究院按照 GB/T 30955-2014、GB 5009.24-2016 的标准对其产毒情况进行测定。

1.2.2 植物乳杆菌及黄曲霉菌形态观察 离心植物乳杆菌发酵液，加入PBS再次离心，之后加入戊二醛（glutaric dialdehyde），置于4℃冰箱固定24 h，重复以上离心步骤，使用不同浓度乙醇（ethanol）脱水，再用叔丁醇（tert-butanol）洗脱溶解，将含有样品的观察皿放入4℃冰箱冷凝约10 min，取出置于真空抽气泵中，待干燥冷凝过夜之后使用扫描电镜观察。将黄曲霉菌用戊二醛在pH7.2的0.1 mol/L的PBS中固定菌丝3 h，将固定菌丝用相同PBS 洗涤3次，采用不同浓度乙醇脱水，脱水后的样品干燥，镀金，进行扫描电镜观察。

1.2.3 植物乳杆菌对黄曲霉菌的破坏 在MRS肉汤中接种浓度为106孢子/mL 的黄曲霉孢子悬浮液，28℃下培养7 d，取出放入4℃冰箱中，作为对照组；将植物乳杆菌接种到MRS肉汤中，35℃下培养2 d，之后接种同等浓度的孢子悬浮液，28℃下培养7 d，作为处理组。然后用扫描电镜观察植物乳杆菌对黄曲霉菌造成的破坏。

1.2.4 抗真菌活性化合物的测定与分析 利用高效液相色谱法（HPLC）分析所含有的抗真菌活性化合物。首先对植物乳杆菌CFS进行pH值调节试验，用1 mol/L的NaOH将CFS的pH调 节 为4.0、5.0、6.0，加入到PDA培养基中，倒平板，在平板中心接种106孢子/ mL的霉菌孢子悬液，于28℃下培养7 d。以未经调整pH的CFS作为对照组。进行3次重复，用尺子测量抑菌圈直径并记录。

1.2.5 植物乳杆菌吸附黄曲霉毒素 在MRS肉汤中接种1×1010CFU/mL的植物乳杆菌，离心菌液，倒掉上清液，用PBS清洗菌体沉淀3次，之后加入AFB1工作液，37℃下培养30 min，以上述相同条件离心，将上清液保存在-20℃的冰箱中，使用HPLC检测AFB1的浓度。对照组为不含乳酸菌的AFB1工作液。对照组和处理组各3个重复。除此之外，测定不同培养时间及加热处理对植物乳杆菌吸附AFB1的影响。根据以下公式计算吸附率：

AFB1吸附率（%）=（1-SAFB1/CAFB1）×100

SAFB1：样品中 AFB1 的峰面积；CAFB1：对照中AFB1 的峰面积。1.2.6 植物乳杆菌在全株玉米青贮饲料中的应用效果 在全株玉米青贮饲料中添加植物乳杆菌及黄曲霉菌，测定发酵0 d、24 d、48 d的指标。青贮后根据德国农业协会的青贮感官评分法对青贮饲料的整体发酵进行评价［16］。制备不同时期的样品悬液，使用涂布平板法计数LAB及霉菌。采用苯酚-次氯酸钠比色法测定氨态氮［17］；HPLC测定有机酸含量［18］；pH计测定青贮浸提液的pH值。干物质（DM）、粗蛋白（CP）、粗脂肪（EE）、粗灰分（Ash）根据AOAC的方法测定［19］；中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）根据Van Soest法测定［20］；高锰酸钾滴定法测定钙（Ca）［21］，钼黄比色法测定磷（P）［22］；蒽酮-硫酸比色法测定可溶性糖（WSC）［23］；高氯酸水解-蒽酮比色法测定淀粉（starch）［24］。饲料发酵48 d后，样品送到蓝德雷检测公司，近红外检测法评定总可消化养分（TDN）、产奶净能（NEL）、维持净能（NEM）、增重净能（NEG）、相对牧草质量（RFQ）及产奶量（Kg Milk）。饲料样品于室温下开口放7 d，观察霉变情况，且将霉变饲料送至北京清析技术研究院测定其产毒情况。发酵结束后开封，在装有样品的不同青贮袋中间插入测温棒，仪器每隔30 min记录一次温度，当仪器显示饲料中心温度大于周围温度2℃时［25］，此时认定饲料开始有氧腐败，并且记录时间。相对饲喂价值（RFV）及康乃尔净碳水化合物-蛋白质体系（CNCPS）中碳水化合物的组分含量根据以下公式计算：

RFV=DMI（%BW）×DDM（%DM）/1.29；

DMI（%BW）=120/NDF（%DM）；

DDM（%DM）=88.9-0.779×ADF（%DM）

DMI：干物质采食量；BW：体重；DDM：可消化干物质。

CHO=100-CP-EE-ASH；CC=LIGNIN×2.4；CB1=STARCH；CA=WSC。

CHO：总碳水化合物；CC：不可利用纤维；CB1：淀粉；CA：可溶性糖。

1.2.7 数据处理 所测得的实验数据用Excel整理，之后通过SPSS 24.0的统计软件对数据进行单因素方差分析（ANOVA），然后采用Duncan法进行多重比较分析，以P＜0.05作为差异显著的判断标准，试验结果用平均值±标准差来表示，之后使用Origin 2019进行绘图。

2 结果

2.1 黄曲霉菌产毒性能分析

黄曲霉菌产毒情况示于表1中，只产生26.0 μg/kg的AFB1和2.8 μg/kg的AFB2。

表1 霉菌产毒特性Table 1 Toxigenic characteristics of mold

2.2 植物乳杆菌及黄曲霉菌形态观察

两种菌株在扫描电镜下的形态观察如图1所示，植物乳杆菌两端圆，中间直，呈圆端直杆状，单个、成对或短链状出现；黄曲霉菌分生孢子梗粗糙，顶囊呈圆球形，菌丝表面光滑，无褶皱，且分生孢子在小梗上链状着生。

图1 植物乳杆菌（A）及黄曲霉菌（B）扫描电镜图Fig. 1 Scanning electron micrograph of L. plantarum（A）and A. flavus（B）

2.3 植物乳杆菌对黄曲霉菌的破坏

植物乳杆菌对黄曲霉菌形态破坏如图2所示。左边是正常黄曲霉菌的菌丝体，表面光滑，无褶皱断裂，菌丝生长良好，没有任何生长异常；右边是用植物乳杆菌处理过的黄曲霉菌，与左边相比，观察到菌丝生长异常，表面不光滑，有大量皱缩和扭曲状态，菌丝体形态遭到破坏。证明植物乳杆菌对黄曲霉菌的生长具有一定的抑制作用。

图2 正常菌丝（A）及异常菌丝（B）扫描电镜图Fig. 2 Scanning electron micrograph of normal hyphae（A）and abnormal hyphae（B）

2.4 抗真菌活性化合物的测定与分析

CFS中存在LA、AA、丙酸（PA）及苯乳酸（PLA），其含量如图3所示。4种有机酸的含量分别为19.770、8.870、2.900、0.006 mg/mL，LA最 多，显著高于其他有机酸（P＜0.05）。由表2可知，与对照组相比，CFS进行pH调节后，随pH增加，酸性减弱，抑菌圈直径缩小，乳酸菌抑制霉菌能力减弱，最后抑菌能力彻底消失；相反，CFS的pH值越小，酸性越强，抑菌圈直径越大，对霉菌的抑制效果越高。未调节pH和pH 4.0的CFS中，抑菌活性最大，pH为6.0时，抑菌活性消失。表明植物乳杆菌CFS的抑菌活性受到pH值变化的影响较大。

表2 pH对CFS抑霉活性的影响Table 2 Effect of different pH on the inhibition of mould activity of cell-free supernatant

图3 CFS中的有机酸含量Fig. 3 Content of organic acid in CFS

2.5 植物乳杆菌吸附黄曲霉毒素

植物乳杆菌对AFB1的吸附率为59.40%。不同培养时间及加热处理下，植物乳杆菌对AFB1的吸附效率如图4所示。培养4 h后吸附效率最高，为59.53%，4 h热处理后，吸附效率最低，为59.25%。热处理30 min及4 h后，吸附效率显著降低（P＜0.05）。未加热时，植物乳杆菌对AFB1的吸附效率不会随着培养时间的延长而吸附更多毒素。

图4 不同处理对AFB1吸附率的影响Fig. 4 Effects of different treatments on the adsorption rate of AFB1

2.6 植物乳杆菌在全株玉米青贮饲料中的应用效果

全 株玉米原料的DM为68.30%，CP含量为8.95%，NDF与ADF的 含 量 分 别 为57.57%和34.47%，WSC的含量为11.71%，淀粉的含量为18.64%。

由表3可知，L和L+A组等级为优，且L组评分最高，CK和A组等级为良。接种植物乳杆菌的处理组散发出较浓的芳香味，发酵品质较高，茎叶结构完整，青贮后饲料的颜色与青贮前饲料的颜色较为接近。

表3 全株玉米青贮饲料的感官评定Table 3 Sensory evaluation of whole crop corn silage

在不同发酵时期测定青贮饲料中LAB及霉菌数量，结果如表4所示。随发酵天数增加，各处理组的LAB数量先增加后减少，L和L+A组的LAB数量显著高于CK和A组（P＜0.05）。在24 d时，A组LAB的数量显著高于CK组（P＜0.05）。在0 d时，存在霉菌，且霉菌数量之间没有显著差异，随发酵天数增加，霉菌随之消失。

表4 全株玉米青贮发酵过程中乳酸菌及霉菌数量Table 4 Number of lactic acid bacteria and molds during fermentation of whole crop corn silage（log CFU/g）

全株玉米青贮饲料在发酵0 d、24 d、48 d后，氨态氮及pH值变化如图5所示。随发酵时间增加，氨态氮含量逐渐上升，pH值逐渐下降。在0 d时，4组之间的氨态氮含量及pH值没有显著差异。在24 d时，CK和A组的氨态氮含量及pH值高于L及L+A组（P＜0.05）。在48 d时，L组的氨态氮含量显著低于CK组（P＜0.05），虽然L组的含量低于A和L+A组，但是没有显著差异。

图5 全株玉米青贮发酵过程中氨态氮（A）及pH（B）的变化Fig. 5 Changes of ammonia nitrogen（A）and pH（B）during the fermentation of whole crop corn silage

有机酸的含量变化如表5所示。在不同发酵时期都产生了乳酸和乙酸。乳酸和乙酸含量与青贮饲料的发酵时间呈正相关，发酵时间越长，其含量越多。在24 d和48 d时，L以及L+A组的乳酸和乙酸含量高于CK及A组（P＜0.05）。在48 d时，CK及A组的丙酸含量显著低于L及L+A组（P＜0.05）。在3个不同时期没有丁酸产生。

表5 全株玉米青贮发酵过程中有机酸含量Table Organic acid content during fermentation of whole crop corn silage

全株玉米青贮饲料在发酵0 d、24 d及48 d后，营养成分的变化如表6所示。随发酵时间增加，DM及其DMR下降，0 d时，4组之间含量差异不显著，24 d和48 d时，CK和A组的DM及其DMR显著低于L和L+A组（P＜0.05）；CP及Ash含量上升，EE下降，24 d时，L+A组的CP含量显著低于其他组（P＜0.05），且CP含量最低为7.5%，0 d和48 d时，4组之间CP含量差异不显著，48 d后，L组CP含量最高，为10.85%，EE及Ash含量在4种不同处理下差异不显著，48 d时，L+A组的EE含量最低，CK组的Ash含量最高；NDF和ADF含量下降，0 d时，4组之间没有显著差异，且在0 d时值最大，NDF为59%，ADF为36%，24 d和48 d时，CK及A组 的NDF和ADF含量显著高于L及L+A组（P＜0.05）。添加微生物对Ca及P的含量变化没有显著影响，发酵24 d及48 d后，Ca及P的含量显著高于0 d时的含量（P＜0.05）。WSC及Starch随青贮发酵时间增加出现降低，0 d时，4组WSC及Starch含量之间没有显著差异，24 d和48 d时，L及L+A组的WSC含量显著高于CK及A组（P＜0.05），L及L+A组的Starch含量显著低于CK及A组（P＜0.05）。

RFV的含量变化如图6所示。RFV含量随发酵时间增加呈现上升。0 d时，CK组与其余3组的RFV之间没有显著差异，约为97%。随发酵时间增加，24 d和48 d时，CK及A组的RFV显著低于L及L+A组（P＜0.05）。

图6 全株玉米青贮发酵过程中相对饲喂价值变化Fig. 6 Changes in relative feeding value during the fermentation of whole crop corn silage

发酵48 d后，TDN、NEL、NEM、NEG、RFQ、产奶量（Kg Milk）的变化如表7所示。与CK组相比，添加微生物后NEG有所提高，且L+A组的含量显著高于CK组（P＜0.05）。

表7 全株玉米青贮饲料饲用价值Table 7 Feeding value of whole crop corn silage

表6全株玉米青贮发酵过程中营养成分测定Table 6 Determination of nutritional components during the fermentation of whole crop corn silage

发酵结束后，CNCPS体系中碳水化合物的组分变化如表8所示。4组的CHO含量没有显著差异。CK组的CC含量高于其余3组，但是没有显著差异。CK及A组的CB1含量显著高于L以及L+A组（P＜0.05）。L组的CA含量显著高于CK及A组（P＜0.05），但是与L+A组之间差异不显著。

表8 CNCPS体系中碳水化合物组分变化Table 8 Changes of carbohydrate composition in CNCPS system

发酵结束后，将4组样品分别装在不同青贮袋中，在室温下开口放置7 d，观察饲料霉变情况。如图7所示，A组发霉情况最严重，饲料表面及内部均有大量霉菌生长，且有异味；L组发霉情况最轻，只有零星部位出现霉菌。L+A组发霉情况介于L和A组之间，内部没有发霉，饲料表面发霉，发霉情况稍重于L组。CK组发霉情况重于L+A组。

图7 饲料有氧暴露下发霉情况Fig. 7 Mold development under the aerobic exposure of feed

4组样品二次发酵后，饲料表面出现霉菌，A组最严重。将样品送到检测公司测定霉菌的产毒情况。4组样品中均未检测出毒素，表明添加的产毒霉菌在饲料中没有产生毒素。

发酵结束后，对4组饲料及周围温度进行实时监测，以绘制有氧稳定性曲线，如图8所示。4组青贮饲料的中心温度变化与周围温度的变化趋势相一致。10 d时，A组的温度比环境温度高2℃。30 d之前，其余3组的温度都大致低于环境温度，从30 d开始缓慢高于周围温度，30 d时，CK组的温度比环境温度高2℃，31 d时，L和L+A组的温度比环境温度高2℃。这表明，添加植物乳杆菌可以增加饲料有氧稳定性的时间，避免饲料迅速变质。

图8 全株玉米青贮饲料有氧稳定性变化Fig. 8 Changes of aerobic stability of whole crop corn silage

3 讨论

LAB能够利用碳水化合物产生大量乳酸［26］。黄曲霉菌在粮食作物及谷物饲料中出现频率最高，黄曲霉毒素是其产生的极毒性代谢产物，它会导致畜禽流产、胚胎畸形，且对畜禽体内的免疫系统造成严重破坏、对肝细胞产生一定毒性［27］。LAB对霉菌具有抑菌效果，其中植物乳杆菌效果最强［28］。乳杆菌可以显著抑制霉菌生长并降解毒素，菌丝体生物量和黄曲霉毒素产量明显减少，降解率高达96.31%［29］。pH是影响LAB抑菌活性的主要因素，pH越高，抑菌活性越低［30］。0.5%的乙酸和丙酸可以抑制霉菌生长，同时丙酸也显示出有效的抗黄曲霉毒素活性［31］。苯乳酸是近期发现的一种新型抗真菌物质，与其他抑菌物质相比，其具有较为广泛且有效的抑菌作用，在抑制霉菌生长中起到了重要作用［32］。本研究采用HPLC测定了乳酸菌对AFB1的吸附率，高于马惠茹等［33］采用酶联免疫法测得乳酸菌对AFB1的4.76%吸附率。不管是同型发酵乳酸菌还是异型发酵乳酸菌都对霉菌毒素有一定的降解作用［34-36］，可能是本研究未能测出霉菌毒素的原因。

玉米青贮饲料在饲喂牛羊等动物中不可缺少［37］。这类饲料营养丰富、适口性好、生物学产量高、贮藏时间长［38］。张适等［39］的研究表明，青贮饲料中添加植物乳杆菌，其饲料等级最高，且发酵品质大幅提升。袁仕改［40］的研究表明，添加LAB的处理组，饲料发酵效果优于其他组，且pH值均低于青贮饲料的临界值。氨态氮含量直接影响饲料的适口性和营养价值，其含量与蛋白氮降解率呈正相关，表明氨态氮对青贮饲料的发酵有不利影响［41-42］。添加植物乳杆菌使青贮饲料中氨态氮含量降低［43］，本研究添加植物乳杆菌氨态氮含量变少，与之结果一致。张相伦等［44］的研究结果证明，在玉米秸秆制作而成的青贮饲料中添加复合乳酸菌使CP含量显著增加。玉米秸秆中存在着较多的WSC，乳酸菌的定植需要WSC为其提供有利条件［45］。本研究中矿物元素的变化不受微生物影响，而受发酵时间影响，发酵结束后饲料中矿物元素的含量高于未发酵时的含量，此结果与王赫［46］的研究结果相一致。

4 结论

植物乳杆菌破坏黄曲霉菌结构且抑制其生长，同时有效吸附毒素，吸附率达到59.40%。植物乳杆菌CFS中有乳酸、乙酸、丙酸及苯乳酸等抑菌成分。添加植物乳杆菌使青贮饲料感官评价得分较高，且有效改善发酵品质及营养成分，延长有氧稳定性，阻止饲料迅速发生霉变，从而提高饲料安全性。