发酵TMR应用及其微生物种群演替规律研究进展

江迪 徐春城

（1. 河南工业大学粮油食品学院，郑州 450001；2. 中国农业大学工学院，北京 100083）

畜牧业是我国现代农业的重要组成部分，随着我国人民生活水平的不断提高，人们对肉蛋奶等畜产品的需求量越来越大。2019年全年肉蛋奶产量约为1.4亿t，其中牛奶产高达3 201万t，与2018年相比增长4.1%，同比增长率创下了近5年的新高［1］。畜产品需求量的稳步增长促使我国饲料粮的需求量不断增加，粮食的供求长期处于紧平衡状态，其中饲料用粮占粮食消费的40%以上，超过人对粮食的消费，“人畜争粮”问题严重［1-2］。因此，为了缓解饲料粮对我国粮食产业的巨大压力，减少畜牧业对粮食的依赖，加强非常规饲料资源的开发利用对促进我国畜牧业的发展至关重要。我国非常规饲料资源丰富每年近40亿t。然而这些饲料资源通常因为水分含量高、营养成分不均衡、适口性差、消化率低等问题导致其应用范围受到限制［3］。发酵全混合日粮（total mixed ration silage，TMR）作为一种在TMR调制加工技术上发展起来的新型饲喂技术，其推广和普及能够有效利用非常规饲料资源，缓解饲料资源短缺制约我国畜牧业稳定发展的难题［4］。由于发酵TMR厌氧发酵过程中的环境复杂，其微生物组成也多种多样。因此饲料中的微生物组成对饲料的发酵品质及有氧稳定性都有重要作用。本文通过综合阅读近些年国内外关于发酵TMR研究的文献，对TMR发酵过程及有氧状态下的微生物种群进行分析，初步总结了发酵TMR应用及其微生物种群多样性的研究现状。

1 发酵TMR技术及应用

1.1 发酵TMR的加工工艺

发酵TMR是根据家畜不同生产阶段的营养需要和饲料原料的营养价值，设计科学合理的日粮配方，经过乳酸菌厌氧发酵调制而成的一种营养平衡的日粮。日本早在20世纪90年代开始发酵TMR技术的研究，通过该方法使高水分食品副产物等非常规饲料能够长期贮藏并有效利用。发酵TMR技术融合了TMR技术与青贮技术，不仅能够有效保全了TMR的营养成分，同时发酵产生的生物活性物质又增加了饲料的附加价值［5］。由于饲料的质量通常会直接影响奶牛的产奶量、乳品质、泌乳年限及奶牛健康，因此，需要根据奶牛生长阶段的营养需求对配方进行严格的设计。一般来说，用于调制发酵TMR的原料主要包括以下饲料（表1）。我国每年有大量的糟渣、秸秆等农产品加工副产物产生，然而利用率都不高，不但造成资源的浪费，同时还污染环境。利用农产品加工副产物调制发酵TMR能够充分开发利用非常规饲料资源，在一定程度上解决我国饲料粮资源的不足，缓解人畜争粮的矛盾，保护环境。利用高水分的农产品加工副产物与其他原料混合后制备发酵TMR，不仅能够有效保存原料中的营养成分、提高有机酸、酶、维生素等功能性成分的含量，加之TMR的发酵品质良好，而且有氧稳定性得到显著提高，促进了发酵TMR的商品化流通［6］。

表1 发酵TMR的原料组成Table 1 Raw material composition of TMR silage

1.2 发酵TMR的生产应用

在我国，规模化牛场已经采用TMR 饲喂技术。TMR 饲喂方式能够有效避免奶牛挑食和营养失衡状况的发生；而且能够增强瘤胃机能，维持瘤胃pH稳定，降低奶牛发病率。发酵TMR作为一种在TMR调制加工技术上发展起来的新型饲喂技术，不仅能够提高饲料适口性，同时能够进一步提高饲料价值，保证奶牛机体健康，提高奶制品品质。研究发现，奶牛饲喂发酵TMR后，干物质采食量（DMI）相比于对照组有了显著的提升；同时，4%的标准乳、乳蛋白和乳糖均提高了10%以上，这些结果表明发酵TMR 对营养物质在反刍动物消化吸收的过程中均具有较好促进效果［7］。以咖啡渣、蘑菇渣、桃渣等农产品加工副产物替代部分精料、干草等常规原料调制TMR，经过发酵后，其乳酸含量显著提高、pH和氨态氮含量显著降低，显著改善了TMR的发酵品质；提高了发酵TMR的适口性、增加了家畜的干物质采食量；且不影响发酵TMR的营养物质消化率及可消化养分总量和消化能；对家畜的血液指标、瘤胃发酵性状无不良影响，同时，像绿茶饮料渣等还能提高家畜的免疫性能［8-11］。可见，使用高水分副产物代替部分原料制备发酵TMR，不仅能够得到品质较好的发酵饲料，而且能够降低生产成本，增加经济效益。一些营养成分较少，适口性差的作物秸秆单独作为饲料使用时，其能量和消化率都比较低，然而当使用这类原料与副产物共同调制TMR发酵后，能够有效保持其营养成分，提高饲喂价值［12-14］。而且，与某一原料单独青贮相比，将其与其他原料混合调制发酵TMR后无论适口性还是贮藏性都得到了较大的提高［15］。苜蓿是奶牛等草食动物的重要优质饲草，但由于水分含量高，可溶性碳水化合物含量低，缓冲能较高，青贮过程中极易发生丁酸发酵，导致饲草品质下降。而将新鲜苜蓿与玉米粉、豆浆渣、豆粕、预混料等混合调制发酵TMR后，有效解决了苜蓿难以获得优质青贮的技术瓶颈［16］。此外，TMR暴露在空气中48 h内即发生好氧变质，而发酵TMR暴露在空气中7 d内无显著变化，表现出相当好的有氧稳定性；且随着发酵时间的延长，有氧稳定性显著增强［17-18］。

2 发酵TMR好氧变质及其微生物影响因素

2.1 发酵TMR好氧变质

TMR厌氧发酵过程是一个微生物主导的复杂生物化学过程。TMR经过厌氧发酵后，以乳酸菌为主的有益菌，将饲料中的可溶性糖转化为以乳酸为主的有机酸，迅速降低pH，抑制其他好氧微生物对饲料营养成分的降解作用，从而使饲料得到很好的保存。当发酵TMR开封后暴露在空气中，好氧微生物在有氧状态下快速增殖，饲料中的发酵酸和其他底物会被酵母、好氧细菌及霉菌利用，导致饲料发热、pH升高、营养物质损失而发生变质［19］。发生变质的饲料干物质损失严重，其营养价值会随着发酵产物的消耗而降低［20-21］。同时，由于有害微生物的孢子以及代谢过程中毒素的积累［22-25］，奶牛的健康和牛奶的品质也会受到不良影响，进而影响新鲜牛奶和奶制品的安全［5，26-28］。

2.2 好氧变质过程中的微生物影响因素

发酵TMR的好氧变质一般经历3个阶段［27］，当氧气进入到饲料后，酵母首先利用发酵过程中产生的有机酸和残存的可溶性糖大量繁殖，快速提高饲料的温度和pH，为其他微生物的生长提供有利环境［24］；随着pH的升高，好氧细菌开始增殖，进一步消耗饲料中的营养成分，升高饲料温度；最后，霉菌在表面大量生长，饲料完全变质［19］。发酵TMR发生好氧变质的过程中一般会出现两个温度高峰［29］，第一个温度高峰与酵母菌或者好氧乙酸菌的生长增殖有关，第二个温度高峰则反映了霉菌的生长［27］。Wang等［15］在对全株玉米发酵TMR好氧变质过程中的温度监测中发现，整个过程中共检测到了两个温度高峰，第一个温度高峰与最大酵母数量一致，且在有氧状态下检出了数量较高的好氧细菌，表明需氧细菌在后期降解中的作用。发酵TMR在有氧变质的过程中，乳酸等发酵酸被迅速代谢，饲料pH快速升高，从而引起梭状芽胞杆菌的增殖，导致蛋白质和碳水化合物的大量损失。梭状芽胞杆菌（Clostridium）一般是严格厌氧或者微需氧的芽胞杆菌，当好氧细菌利用乳酸产生酸性终产物较少时，饲料的pH显著增加，一些兼性厌氧微生物进一步消耗氧气和发酵终产物，在饲料局部形成一个厌氧高pH的小环境，为梭状芽胞杆菌的生长提供有利条件，使其在好氧变质过程中数量增加，加速好氧变质发生［30］。而霉菌的大量出现意味着饲料中的乳酸含量较低，pH较高，此时饲料发生变质，失去饲喂价值［31］。其中，酵母被认为是好氧变质过程中最重要的微生物［24］。由于酵母喜在糖分高的偏酸环境中生长，因此虽然在厌氧发酵过程其生长会受到抑制，一旦饲料开封后，充足的底物和适宜的环境使酵母首先快速增值，提高饲料pH，为其他好氧微生物的生长提供有利环境。因此，在发酵过程中存活下来的酵母菌被认为是引起饲料好氧变质的主要微生物［24］。Beck等［32］认为酵母是导致青贮饲料发生好氧变质的主要微生物因素，当青贮饲料中的酵母数量高于105CFU/g FM时，青贮饲料更容易发生好氧变质［33］。许多研究表明，开封时酵母菌的数量是影响青贮饲料有氧稳定性的重要因素，且随着酵母菌数量的减少，有氧稳定性增强［28，34-35］。然而Hu等［10］对发酵TMR有氧稳定性的研究发现，以苜蓿为主要原料调制的TMR经过56 d发酵后，虽然酵母菌的数量达到104CFU/g FM以上，但发酵TMR在6 d内并未发生好氧变质。因此，可以推测开封时酵母的种类比数量对有氧稳定性的影响更大。一般来说，在发酵过程及有氧状态下被检出的酵母种类有很多（表2）。与好氧变质有关的酵母按照其生理特征可以分为两组，第一组是具有较高糖发酵能力的酵母，如Saccharomyces cerevisiae和Torulopsis spp.；第二组是具有高有机酸亲和力的酵母，如Candida、Issatchenkia、Pichia、Hansenula和Endomycopsis［36］。其中，Pichia和Candida由于其高乳酸同化能力和高葡萄糖亲和能力而在好氧变质过程中检出率较高［24］。这类酵母往往是影响饲料好氧变质的关键因素。

表2 发酵过程及有氧状态下的主要酵母Table 2 Main yeasts during ensiling and aerobic exposure

3 发酵TMR中的微生物种群多样性

3.1 TMR发酵过程微生物种群的动态变化

发酵TMR中的微生物组成对饲料的发酵品质及有氧稳定性均具有重要的影响。针对发酵TMR中微生物种群多样性的研究一直都是研究的热点。对不同季节不同地域发酵TMR中的微生物组成进行分析发现，大部分发酵TMR中，芽胞杆菌和好氧细菌的数量在发酵过程中略有降低；酵母随着发酵时间的延长，其生长逐步受到抑制；7 d后霉菌数量降至检出限以下［37］。乳酸菌是TMR发酵过程中的优势菌，在厌氧发酵过程中的种类较多（表3）。其中，在厌氧发酵前期的乳酸菌主要为Lactobacillus casei、Lactobacillus brevis、Tetragenococcus halpphilus、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus plantarum、Pediococcus pentosaceus、Weissella paramesenteroides和Pediococcus acidilactici，而 到 了 发 酵 后 期，Lactobacillus代替Lactococcus成为发酵TMR中的优势乳酸菌［10，38］。TMR发酵过程中微生物种群常常与营养成分的降解密切相关。半纤维素的降解通常发生在厌氧发酵早期，Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus licheniformis、Bacillus subtilis、Bacillus pumilus和Paenibacillus xylanexedens是 降 解 半 纤维素的主要微生物；B. amyloliquefaciens、Bacillus cereus、B. licheniformis、B. subtilis、Bacillus flexus和P.xylanexedens在发酵前期与淀粉的降解密切相关，而Enterococcus faecium是发酵后期降解淀粉的主要微生物［39］；降解蛋白的细菌主要属于Curtobacterium和Paenibacillus，其中Curtobacterium flaccumfaciens、Paenibacillus amylolyticus、Paenibacillus borealis、P.xylanexedens和Paenibacillus turicensis为 发 酵TMR中微生物蛋白酶的主要来源；到了发酵后期，E.faecium成为发酵TMR中降解蛋白的主要细菌［40］。发酵TMR中酵母随着发酵时间的延长其生长逐渐受到抑制，而开封后检出的酵母通常被认为是导致好氧变质的主要微生物。Pichia kudriavzevii、Kazachstania exigua、Kluyveromyces marxianus和Candida milleri常常在发酵TMR中被检出，抑制K.marxianus和P. kudriavzevii的生长能够在一定程度上改善发酵TMR的有氧稳定性［38，41］。

表3 厌氧发酵过程的常见乳酸菌Table 3 Main lactic acid bacteria during ensiling

近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，高通量测序技术（high-throughput sequencing）被广泛用于发酵TMR微生物种群多样性的研究，使得我们对发酵过程的微生物种群有了进一步了解。Pediococcus、Lactobacillus等乳酸菌属的相对丰度通常在发酵过程中显著增加，抑制了Erwinia、Pseudomonas等有害细菌相对丰度的增长；随着发酵时间的延长，Cryotococcus、Pseudozyma等真菌菌属的相对丰度逐渐降低，真菌的生长逐渐受到抑制；许多发酵TMR开封时酵母和霉菌的数量处于检出限以下，而通过高通量测序技术发现，Pichia、Candida、Aspergillus和Phanerochaete均能够在开封时被检出，其相对丰度随着发酵时间的延长显著增加［16，18］。

3.2 发酵TMR有氧状态下的微生物种群多样性

开封后，发酵TMR中的无氧环境由于氧气的进入发生变化，饲料中的微生物组成随之改变。发酵TMR在有氧状态下的细菌种群没有显著变化，Lactobacillus、Pediococcus和Erwinia无论在原料、发酵过程还是有氧状态下均能够被检出［16，42］。Pichia、Cryptococcus和Candida是有氧状态下的主要酵母，其中Pichia与发酵TMR的好氧变质密切相关，P.kudriavzevii和Pichia manshurica均被认为是导致发酵TMR好氧变质的主要酵母，抑制Candida humilis在一定程度上够提高发酵TMR的有氧稳定性；而在一些长期发酵的TMR中，Zygosaccharomyces bailii被认为是引发好氧变质的主要酵母［17-18，41，43］。霉菌一般出现在有氧状态后期，Cladosporium、Alternaria、Aspergillus和Monascus均是有氧状态下常见的霉菌属；当发酵TMR好氧变质后，Monascus的相对丰度能够达到80%以上，为发酵TMR中的主要真菌［16，18，44］。

4 总结与展望

发酵TMR技术的普及和推广对于提高非常规饲料资源的利用效率，解决饲料资源短缺问题具有重要意义。而关于发酵TMR有氧稳定性及其微生物种群多样性的研究对促进发酵 TMR技术的推广至关重要。目前，通过传统分离纯化技术、DGGE技术以及高通量测序技术对发酵TMR发酵过程及有氧状态下的微生物种群多样性进行了一系列的研究并取得了一定的研究结果，但是仍存在一定的不足。传统微生物分离鉴定方法由于实验室培养条件及微生物生长条件的限制，很难对微生物种群整体进行分析。近些年，高通量测序技术已成为研究饲料中微生物组成的常用方法。这种方法能够对微生物种群进行更全面的分析，但是由于测序的通量较大，所以在确定到菌株水平上的准确率较低；同时，由于高通量测序技术直接提取样品中的微生物总DNA进行微生物群落的分析，单纯的相对丰度并不能显示实时的微生物组成，因此单纯的高通量测序技术在准确分析实时微生物菌群构成上存在一定的缺陷；在提供有关微生物群落代谢活性的定量数据方面也仍然存在问题。在未来的研究中，可以将一二代测序方法结合起来，使二者相互补充，能够更好地对发酵TMR中的微生物种群进行分析。随着现代分子生物技术的发展，第三代测序技术（PacBio Single Molecule）越来越多地被应用到青贮饲料发酵过程的微生物种群的测定上，该技术结合实时测序技术（real-time sequencing technology，SMRT）能够更准确的评估饲料中物种水平上的微生物群落。然而该技术在发酵TMR中的应用还较少，在未来的研究中，利用更新、更高效的现代生物学手段对TMR发酵过程及有氧状态下的微生物种群进行更深入的分析，并采用代谢组学技术分析优势微生物的代谢途径与代谢产物，进一步分析TMR发酵过程中营养成分的代谢规律，为发酵TMR技术的普及和推广提供坚实的理论基础。