重组甘油单酯脂肪酶GMGL的高效表达及固定化

牛亚春，蓝东明，王永华，杨博*

（1.华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州 510006）（2.华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）

具有特异性底物专一性的生物酶在工业领域中具有重要的应用价值。与常见的甘油三酯水解酶（EC 3.1.1.3）不同[1-3]，甘油单酯脂肪酶（monoacylglycerol lipases，EC 3.1.1.23）能专一地作用于甘油单酯，将其水解成脂肪酸和甘油[4]。由于其高度专一的底物特异性，可应用于合成高纯度甘油二酯[5]或者甘油单酯[6]，而甘油单酯是重要的乳化剂、稳定剂、药品添加剂及防腐剂等[7,8]。另外，甘油单酯脂肪酶在人体中具有重要的生理调控作用，如介导2-花生四烯酸甘油酯（2-AG）信号传导和花生四烯酸代谢[9,10]，是重要的药物研发靶蛋白。

微生物来源的甘油单酯脂肪酶具有显著的耐热性能及催化活力，更具有工业应用潜力，其发掘及结构功能的研究一直是热点。Imamural等[4]对来源于Bacillussp. H-257的甘油单酯脂肪酶MGLP的酶学性质进行了研究，结果表明其最适反应温度为75 ℃，最适pH 6～8；Riegler-Berket等[11]研究了来源于Arabidopsis thaliana的甘油单酯脂肪酶AtMAGL的底物特异性、区域特异性及脂肪酸特异性；Kim等[12]研究了甘油单酯脂肪酶MGL的盖子结构及功能关系；随后，唐薇[13]对来源于Geobacillussp.12AMOR1的甘油单酯脂肪酶GMGL进行克隆表达，首次解析了海洋微生物来源的甘油单酯脂肪酶的晶体结构，并研究了GMGL识别及水解底物的过程。

固定化酶是提高游离酶应用性能的有效方法之一，如提升生物酶的稳定性，延长使用寿命及生产成本低等优点[14-16]。常见的固定化方法主要包括吸附法、包埋法、共价结合法、交联法和热处理法等，其中吸附法是通过疏水相互作用、范德华力等物理相互作用力，将酶分子和树脂相互结合，使用此类结合方法常见的树脂有大孔吸附树脂，但其固定后的酶分子易脱落，性能不稳定，影响固定化酶的重复利用。因此，为解决大孔吸附树脂所固定的酶使用寿命短的问题，寻找一种新的树脂用于固定化很有意义。ECR8285树脂是一种环氧丙烯酸酯树脂，主要通过共价结合作用使酶分子表面上的非必需基团与载体材料表面上的活性官能团实现多点共价结合，与大孔吸附树脂相比，该方法获得的固定化酶具有更高的固定化效率及较长的使用寿命。Li等[17,18]通过共价结合方法将偏甘油酯脂肪酶SMG1-F278N固定在ECR8285树脂，与游离脂肪酶相比，固定化SMG1-F278N的热稳定性显著提高，重复使用7次后催化活力保留率仍为98.00%。由此可见，ECR8285树脂由于其牢固的共价结合方式用于固定化酶载体具有潜在的应用价值。

目前，甘油单酯脂肪酶的研究主要集中在基因挖掘、酶学性质表征及晶体结构与功能的关系等[11,12]，但已报道的甘油单酯脂肪酶产量低，难以满足产业化生产需求及游离酶无法重复利用等缺点，且迄今为止关于重组甘油单酯脂肪酶高效表达的发酵条件优化又尚未报道。因此，为降低产业化成本，提高经济效益，本研究以甘油单酯脂肪酶GMGL重组大肠杆菌为研究对象，在5 L发酵罐中研究了诱导时间、诱导温度、诱导pH以及葡萄糖补料方式对重组工程菌表达甘油单酯脂肪酶的影响，并以环氧树脂ECR8285为固定化材料，研究了酶载量、缓冲盐浓度以及缓冲液pH对GMGL固定化的影响。研究结果为后期甘油单酯脂肪酶的高效表达和固定化酶制备提供研究基础，以期获得生物化工和食品化工领域应用的甘油单酯脂肪酶固定化酶制剂。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与质粒

重组大肠杆菌表达菌株pET30a-GMGL/BL21（DE3）由华南理工大学生物化工实验室构建和保藏。

1.1.2 生化试剂

酵母粉、蛋白胨、一水葡萄糖、卡那霉素等购自国药集团；单硬脂酸甘油酯（MAG）购自上海麦克林试剂有限公司。

1.1.3 主要仪器设备

生化培养箱，重庆市永生试验仪器厂；DYY-8C型电泳仪，北京市六一仪器厂；SKY2102C型摇床，SUKUN；全自动凝胶成像仪，BIO-RAD；5 L发酵罐，上海保兴生物设备工程有限公司；SBA-40D生物传感仪，山东省科学院生物研究所；Merlin型场发射扫描电子显微镜，Zeiss；Nicolet IS50-Nicolet Continuum型傅里叶变换红外光谱仪-红外显微镜，Thermo Fisher Scientific。

1.1.4 培养基

摇瓶种子液培养基（L-1）：10 g胰蛋白胨，5 g酵母粉，10 g NaCl，补加终浓度为50 μg/mL的卡那霉素。

发酵培养基（L-1）：10 g一水葡萄糖，11.5 g酵母膏，19.5 g蛋白胨，4 g (NH4)2SO4，0.9 g柠檬酸，18 g K2HPO4·3H2O，3 g KH2PO4，1.2 g MgSO4（单独灭菌），微量元素液1 mL。

微量元素溶液（L-1）：2.8 g FeSO4·7H2O，2 g MnCl2·4H2O，2.8 g CoSO4·7H2O，1.5 g CaCl2·2H2O，0.2 g CuCl2·2H2O，0.3 g ZnSO4·7H2O，溶于1 mol/L HCl中。

补料培养基（L-1）：600 g葡萄糖，10 g MgSO4·7H2O。

1.2 实验方法

1.2.1 种子液制备

冻存的重组大肠杆菌在LB固体培养基上（含卡那霉素50 μg/mL）37 ℃划线，培养12～18 h。接种单菌落到5 mL LB培养液中，培养温度37 ℃、转速200 r/min的条件培养12～14 h；将上述培养物按1%的接种量加到150 mL LB培养液中，37 ℃、200 r/min振荡培养至对数生长中后期，OD600=2～6左右。

1.2.2 发酵罐培养条件

5 L发酵罐中装液量为3 L，接种量5%，发酵培养温度37 ℃，通过调节搅拌转速和空气流速使溶氧不低于10%，流加氨水控制pH 7.0左右。分批培养4 h后，进行补料培养，葡萄糖流加速度为12.5 g/h。在对数生长期对细胞进行诱导，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为1 mmol/L，27 h时停止补料，31 h时停止发酵。诱导阶段每4 h取样，测定细胞湿重、酶活、葡萄糖残留含量。诱导时间设置为对数生长前期（2 h）、对数生长中期（4 h）和对数生长后期（7 h）；诱导温度设置为25 ℃、30 ℃和35 ℃；诱导pH设置为6.5、7.0和7.5。

葡萄糖流加方式分别设定为恒速流加、变速流加、指数流加和pH-STAT。（1）恒速流加葡萄糖流速为12.5 g/h；（2）变速流加控制发酵液中葡萄糖含量低于5 g/L；（3）指数流加控制比生长速率为0.065 h-1；（4）pH-STAT串联pH和补料，当pH低于7.0时流加葡萄糖。

1.2.3 GMGL酶活力检测

取15 mL发酵液离心去上清，菌体用15 mL pH 7.5的10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液重悬菌体，超声破壁15 min，离心所得上清即为GMGL粗酶液。GMGL酶活力测定参见唐微等的方法[13]并加以修改。取4 g乳化液（4%的聚乙烯醇(PVA):MAG体积比为3:1）加入5 mL pH 7.5磷酸盐缓冲液，空白对照中加入15 mL 95%的乙醇，于150 r/min，60 ℃摇床中预热5 min，预热后加入1 mL稀释适当倍数的酶液，然后反应10 min。待反应结束后立即加入15 mL 95%的乙醇终止反应。反应结束后加入2滴酚酞指示剂，用0.05 mol/L NaOH溶液滴定。在一定反应条件下，每分钟催化底物水解生成1 µmol脂肪酸所需要的酶量定义为1 U。

1.2.4 发酵液中葡萄糖含量测定

用SBA-40D生物传感仪测定发酵液中葡萄糖含量。

1.2.5 GMGL的固定化

将粗酶液浓缩至5000 U/mL，取部分酶液与树脂ECR8285按不同固定化条件进行混合，25 ℃固定时间为8 h。真空泵除去吸附后残液，将待干燥固定化酶置于35 ℃真空干燥箱干燥8 h，控制水分含量在5%以下，4 ℃储存备用。固定化条件：（1）酶载量为50、100、150、200和250 mg/g；（2）缓冲液盐浓度为0.05、0.10、0.30、0.50和1.00 mol/L；（3）缓冲液pH为5、6、7、8、9和10。

1.2.6 固定化GMGL的表征

1.2.6.1 固定化酶GMGL的SEM表征

根据Liu等[19]的方法，利用SEM研究GMGL固定前后环氧树脂ECR8285的表面形貌。

1.2.6.2 固定化酶GMGL的FT-IR表征

FT-IR光谱检测参照Liu等[19]的方法。

1.2.7 固定化酶GMGL的蛋白吸附量测定

蛋白吸附量测定方法参考文献[17]。

1.2.8 固定化酶水解活力测定方法

固定化GMGL酶活力测定参见唐微等[13]方法并加以修改。取4 g已制备好的乳化剂（4%的PVA：单硬脂酸甘油酯体积比为3:1）加入5 mL pH 7.5磷酸盐缓冲液，空白对照中加入15 mL 95%乙醇，设定转速为150 r/min，温度为60 ℃摇床中预热5 min，预热后加入0.01 g固定化GMGL，然后反应10 min。待反应结束后立即加入15 mL 95%的乙醇终止反应。反应结束后加入2滴酚酞指示剂，用0.05 mol/L NaOH溶液滴定。

1.2.9 数据处理

以上每项检测指标均设置三个平行。用Microsoft Excel 2010软件计算所有数据的平均值和标准差，采用Origin 2021软件作图，SPSS 9.0进行分析，显著性水平p<0.05。

2 结果与讨论

2.1 重组大肠杆菌高效表达GMGL的发酵条件优化

2.1.1 诱导时间对重组大肠杆菌表达GMGL的影响

lac启动子是一种常用的由乳糖或其类似物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达的启动子，诱导剂IPTG在不同的生长时期进行诱导，对目的基因的表达会产生显著性差异。Sriubolmas等[20]采用大肠杆菌DH5α（pQEA11）生产青霉素酰化酶时，在对数生长初期和中期进行诱导时，青霉素酰化酶的表达量不高，但在对数生长中后期进行诱导时，青霉素酰化酶的表达量显著提高。因此，分别在对数生长前期、中期和后期添加IPTG进行诱导，探究不同诱导时间对重组大肠杆菌发酵表达水平的影响。如图1c，在对数生长前期和中期进行诱导，菌体生长情况受到影响，最大细胞湿重只能达到99.88 g/L，可能是由于细胞较早地开始合成GMGL，从而给菌体后期的生长带来压力，提前诱导会导致发酵液中的葡萄糖提前积累。如图1a和1b，对数生长后期诱导更有利于细胞的生长和产物的合成，同时提高了细胞对葡萄糖的利用率，发酵31 h时，酶活力达到1550 U/mL，比对数生长前期诱导提高了30.80%，比对数生长中期诱导提高了21.40%。这一结果表明在对数生长后期开始诱导，有利于GMGL的表达，为探究诱导时间对其他重组蛋白表达的影响提供良好的借鉴。

图1 诱导时间对重组大肠杆菌发酵过程的影响Fig.1 Effect of induction time on the fermentation process of recombinant E. coli

2.1.2 诱导温度对重组大肠杆菌表达GMGL的影响

诱导温度是影响菌体生长和调控产物合成的重要因素。丁兰宝等[21]报道较高的诱导温度有利于大肠杆菌的高密度发酵，但低温诱导能提高目的产物的合成，而且在不同培养阶段采用不同的培养温度有利于提高大肠杆菌的生长密度和重组产物的表达量，可缩短发酵周期。此外，一些研究表明，培养温度的升高会导致工程菌的质粒稳定性变差，造成质粒丢失。本研究生探究了不同诱导温度对重组大肠杆菌产GMGL的影响，如图2c，在35 ℃条件下诱导，发酵19 h时，细胞湿重达到最高125.40 g/L，之后细胞湿重开始下降，23 h时发酵液中开始积累葡萄糖，27 h时残糖量达到最高2.40 g/L，酶活达到最高1233 U/mL。在30 ℃的诱导温度下，发酵23 h时，细胞湿重达到最高123.98 g/L。如图2a和2b，随后发酵液中的葡萄糖大量积累，细胞湿重和酶活力开始下降，31 h时酶活力为1075 U/mL。在25 ℃的诱导温度下，发酵19 h时细胞湿重开始下降，但酶活力继续增加，发酵31 h时达到最高1550 U/mL，比30 ℃和35 ℃分别提高了44.19%和29.38%，说明低温更有利于甘油单酯脂肪酶活力的提高。这一现象在其他研究中也有报道[22]，推测一是低温有利于外源蛋白质的有效折叠；二是在低温条件下，乙酸等代谢产物的积累减少，降低了细胞生长过程中的毒害作用。

图2 诱导温度对重组大肠杆菌发酵过程的影响Fig.2 Effect of induction temperature on the fermentation process of recombinant E. coli

2.1.3 诱导pH对重组大肠杆菌表达GMGL的影响

发酵过程中维持稳定的pH是使细胞保持最佳生理状态的必要条件。一方面，外界pH值的变化会通过弱酸或弱碱的变化改变细胞内的pH，从而影响细胞的生理代谢。另一方面，大肠杆菌利用碳源产生的代谢产物即有机酸的积累，会造成pH值的下降；而有机酸的消耗，以及无机氮源的利用，则会造成pH值上升。在发酵过程中，通过流加低浓度的碱对pH进行调节，进而控制发酵液的pH处于适宜的范围内，可以避免pH值的剧烈变化对细胞生长和代谢造成不利影响。分别控制诱导pH为6.5、7.0和7.5，探究了不同恒定pH发酵条件下对甘油单酯脂肪酶重组表达的影响。如图3b和3c，在pH 7.5条件下诱导更有利于细胞的生长，发酵6～23 h时GMGL酶活力更高，发酵31 h时酶活为1485 U/mL。在pH 7.0条件下诱导，相比pH 6.5和pH 7.5，27 h时发酵液中葡萄糖积累量最小为2.05 g/L，且甘油单酯脂肪酶关于葡萄糖的得率最高。如图3a，在pH 6.5条件下诱导时，细胞生长较缓慢，随着发酵时间的延长，发酵液中残糖量逐渐增加，27 h时残糖量最高为3.84 g/L，发酵31 h时GMGL酶活力达到1298 U/mL。结果表明，不同诱导pH对细胞生长影响不大，但pH 7.0更有利于甘油单酯脂肪酶的合成。因此，研究诱导pH对重组蛋白的表达具有重要意义。

图3 诱导pH对重组大肠杆菌发酵过程的影响Fig.3 Effect of induction pH on the fermentation process of recombinant E. coli

2.1.4 葡萄糖流加方式对重组大肠杆菌表达GMGL的影响

大肠杆菌在过量葡萄糖或缺氧的条件下会发生葡萄糖效应，积累大量有机酸而影响重组菌的生长和外源蛋白的高效表达[23]。大肠杆菌高密度发酵中，葡萄糖的合理流加方式是关键的影响因素。分别研究了恒速流加补料、变速补料、指数补料和pH-STAT等4种方式对重组酶表达的影响。如图4c，恒速流加条件下，细胞生长较快，发酵19 h时达到116.75 g/L，由于诱导前期葡萄糖流加速度过快，细胞代谢过快丧失活力，19 h后细胞衰老死亡。变速流加条件下，控制发酵液中葡萄糖残留含量低于5 g/L，限制性地流加葡萄糖，随着发酵时间的延长，酶活力逐渐增加，31 h时达到最高1985 U/mL（图4b），重组蛋白的表达量随发酵时间的变化见4d，蛋白分子量与唐薇[13]预测大小一致，约为28 ku。指数流加条件下，4～19 h细胞能按照恒定比生长速率0.065 h-1生长，但由于发酵液中葡萄糖大量积累，19 h后细胞大量死亡，发酵31 h时酶活达到1255 U/mL。一般来说，细菌比生长速率高乙酸的比生成率就高，当重组菌的生长速率超过某个临界值便产生乙酸[24]，指数流加结果表明，降低该重组大肠杆菌的比生长速率有利于甘油单酯脂肪酶的合成。如图4a，pH-STAT流加条件下，发酵液中葡萄糖含量一直维持在较低水平，且细胞生长缓慢，可能碳源不足，发酵31 h酶活达到1420 U/mL。大肠杆菌代谢葡萄糖产生的有机酸会导致发酵液中pH的降低，pH的下降在一定程度上反映了细胞对葡萄糖的需求，因此通过pH变化调节葡萄糖流加速率可以有效避免葡萄糖和乙酸的积累，但该方法的缺点就是pH的变化相对比较滞后，往往细胞已经处于饥饿状态[25]。

图4 葡萄糖流加方式对重组大肠杆菌发酵过程的影响及GMGL的SDS-PAGE检测Fig.4 Effect of glucose feeding on the fermentation process of recombinant E. coli and SDS-PAGE test results of GMGL

2.2 重组甘油单酯脂肪酶GMGL的固定化

2.2.1 酶载量对GMGL固定化的影响

本实验探究了酶载量对GMGL固定化的影响，结果如图5所示，当酶载量小于100 mg/g时，蛋白吸附量随着酶载量的增加而增加；当酶载量为100 mg/g时，固定化GMGL活力最高为2735 U/g，比活力为32.35 U/mg，蛋白吸附量为84.55 mg/g；当酶载量大于100 mg/g树脂时，蛋白吸附量不会随着酶载量的增加而增大而是逐渐趋于稳定的趋势，说明ECR8285树脂对GMGL的吸附量达到饱和状态。Li等[17]研究发现ECR8285树脂对SMG1-F278N的吸附量也存在一个饱和临界值，为30 mg/g。以上结果表明树脂对酶的吸附都存在一个饱和临界值。酶加量超过这个临界值，在固定化过程中会造成酶原料的浪费，额外增加生产成本。因此，研究酶载量对GMGL固定化的影响，对实现固定化GMGL的低成本的工业化生产具有重要意义。

图5 酶载量对GMGL固定化的影响Fig.5 Effect of lipase/support ratio on the immobilization of GMGL

2.2.2 缓冲液离子强度对GMGL固定化的影响

离子强度影响酶在载体疏水表面的物理吸附。本实验探究了不同离子强度对固定化GMGL活力、比活力及蛋白吸附量的影响，结果如图6所示，在离子强度为0.50 mol/L时，酶活力达到2925 U/g，比活力为39.63 U/mg，蛋白吸附量为73.79 mg/g，相比低离子强度条件下（0.05 mol/L）酶活力提高了181.25%，这表明GMGL固定化最适的离子强度是0.50 mol/L，Li等[17]通过提高盐离子强度使固定化SMG1-F278N的酶活力提高了275.00%。这些结果表明提高盐离子强度有助于固定化酶活力的提高。分析原因是高离子强度缓冲液有利于酶与载体的疏水表面发生吸附，进一步有助于载体的环氧基团与酶的氨基或巯基发生反应，形成非常稳定的共价键，提高酶的有效吸附率[26]。这一研究结果为后期环氧树脂做固定化材料提供合适的缓冲液离子强度参考值，具有重要意义。

图6 缓冲液离子强度对GMGL固定化的影响Fig.6 Effect of buffer ionic strength on the immobilization of GMGL

2.2.3 缓冲液pH对GMGL固定化的影响

缓冲液的pH值是影响固定化酶活力的关键因素，因为它会影响酶的活性构象和结构[17]。因此，本实验探究了不同pH对GMGL固定化的影响，结果如图7所示，GMGL固定化最适缓冲液pH为9，固定化GMGL活力为4770 U/g，较pH 5提高了189.09%。不同缓冲溶液pH值的蛋白吸附量几乎一致，但比活力和酶活力都先增加后减小。这一结果与Harris等[27,28]报道一致，表明酶活性中心的解离基团随固定化体系pH值的变化而变化，从而影响固定化酶的活性。因此，选用酶载量为100 mg/g、缓冲液离子强度为0.50 M和缓冲液pH为9的条件，用于制备固定化GMGL的工艺，为甘油单酯脂肪酶的固定化研究提供了理论依据。

图7 缓冲液pH对GMGL固定化的影响Fig.7 Effect of initial pH of buffer on the immobilization of GMGL

2.3 固定化GMGL的表征

2.3.1 固定化GMGL的SEM表征和FT-IR表征

利用SEM对环氧树脂ECR8285，固定化GMGL及游离GMGL进行比较分析。由图8可见，环氧树脂ECR8285表面较光滑，而固定GMGL之后，其表面有明显凸起附着物，表明GMGL酶分子与环氧树脂ECR8285成功结合[29,30]。进一步利用FT-IR进行表征分析（图9），固定化GMGL和游离GMGL分别在1562.34 cm-1和1631.77 cm-1出现蛋白质特有的一级结构中-NH-键的吸收峰，而在ECR8285树脂红外光谱中未发现-NH-键的吸收峰，再次表明游离GMGL已成功固定在ECR8285树脂上。

图8 ECR8285(a)、固定化GMGL(b,c)和游离GMGL(d)电镜图 Fig.8 Scanning electron micrographs of surface of resin ECR8285 (a)，immobilized GMGL (b,c) and free GMGL (d)

图9 游离GMGL、固定化GMGL和ECR8285树脂的FT-IR图谱Fig.9 FT-IR spectra of free GMGL, immobilized GMGL and resin ECR8285

3 结论

本研究在5 L发酵罐体系中探究了不同诱导时间、温度、pH和葡萄糖补料方式对重组大肠杆菌生长和甘油单酯脂肪酶GMGL合成的影响。确定了最佳发酵条件为重组大肠杆菌在25 ℃，pH 7.0，对数生长后期进行诱导，葡萄糖流加方式为变速流加，优化后甘油单酯脂肪酶酶活力达到1985 U/mL，较优化前提高了67.50%。通过共价结合的方式将GMGL固定到环氧树脂ECR8285上，对GMGL进行固定化研究，确定最佳固定化条件为酶载量为100 mg/g，磷酸盐缓冲液离子强度为0.50 M，pH为9，优化后固定化酶GMGL活力为4770 U/g，较优化前提高了189.09%。利用扫描电镜（SEM）和傅里叶红外光谱（FT-IR）进行表征，证实GMGL成功负载在ECR8285上。本研究首次将甘油单酯脂肪酶成功固定在ECR8285上，丰富了固定化酶制剂种类，优化结果也为甘油单酯脂肪酶固定化酶的工业化生产及应用提供了一种新策略。