柿叶中单宁的提取工艺

林 蓂，杨 姗，吴静澜，2，3，张天生，张高红

（1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；2.贵州省中药民族药炮制与制剂工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025；3.国家苗药工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025；4.贵州康琦药械有限公司，贵州 惠水 550600）

柿叶为柿树科（Ebenaceae）柿树属（Diospyros L.）植物柿（Diospyros kaki）的新鲜或干燥叶子，主要含有有机酸、黄酮、三萜及多酚等有效化学成分[1]，其中，多酚类成分主要为单宁。有试验证明，多酚类物质具有较强的抗氧化作用以及清除自由基的能力[2-3]，在护肤品中有抗氧化、抗衰老、抗紫外线、增白等多种作用[4]，所以柿叶提取物常作为美容护肤的原料。但目前关于柿叶中单宁提取方法的研究较少，且单宁的提取率不高[5]。为了提高柿叶中单宁的提取率，本研究以水为溶剂对柿叶中的单宁进行提取工艺研究，并通过正交试验法对提取工艺进行优化。

1 仪器与试药

1.1 仪器

紫外-可见分光光度计（UⅤ-5900，上海元析仪器有限公司）、电热鼓风干燥箱（GZX-9240MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、恒温水浴锅、电子天平等。

1.2 试药

柿叶经贵州中医药大学药学院鉴定教研室丁宁老师鉴定为正品。没食子酸对照品（110831-201605，中国食品药品检定研究院），钨酸钠、钼酸钠、磷酸、盐酸、硫酸锂、无水碳酸钠等均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 柿叶中单宁质量分数的测定

2.1.1 钨酸钠-钼酸钠混合溶液的配制

于250.0 mL圆底烧瓶中加入钨酸钠8 g、钼酸钠2 g、蒸馏水56.0 mL、磷酸4.0 mL及盐酸8.0 mL，充分混匀，文火加热回流2.0 h后，去冷凝管，加入硫酸锂4 g、蒸馏水4.0 mL，混匀，定容于100.0 mL棕色容量瓶中[6]。

2.1.2 对照品溶液的制备

精确称取没食子酸标准品2.53 mg，加入蒸馏水定容于100.0mL棕色容量瓶中，得质量浓度为0.025 3 mg/mL的对照品溶液。

2.1.3 标准曲线的建立

精确吸取1.0、1.2、2.0、3.0、4.0、5.0 mL没食子酸对照品溶液，分别加入1.5 mL钨酸钠-钼酸钠混合溶液、10.0 mL蒸馏水，用70 g/L Na2CO3定容于25.0 mL棕色容量瓶中，30 ℃显色1.5 h后，在765 nm下测得溶液吸光度[7]。以没食子酸对照品溶液的质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标作图，得标准曲线（见图1）：y=116.19x+0.025 4，r=0.999 9，R2=0.999 8。

图1 没食子酸溶液标准曲线

2.1.4 柿叶中单宁的提取及测定方法

称取适量柿叶，加入一定比例的蒸馏水，置于恒温水浴锅中加热回流，过滤得到滤液，定容后取待测样品溶液 1.0 mL，与对照品同法测定吸光度，以标准曲线计算单宁的质量分数。

2.2 单因素试验

2.2.1 不同种类柿叶中单宁质量分数的比较

分别取新鲜柿叶、干燥新鲜柿叶与干燥落柿叶各1 g，以水为提取溶剂，料液比为1∶30，在100 ℃条件下提取1次，提取时间为1.0 h，测得单宁质量分数作为评价指标（见图2）。

图2 不同种类柿叶中单宁的质量分数

由图2可知，干燥新鲜柿叶中单宁的质量分数高于新鲜柿叶和干燥落柿叶，因此，选用干燥新鲜柿叶进行后续工艺优化试验。

2.2.2 提取时间的考察

取干燥新鲜柿叶1 g，以水为提取溶剂，料液比为1∶30，在60 ℃条件下提取1次，以提取时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 h时测得的单宁质量分数作为评价指标（见图3）。

图3 提取时间对柿叶单宁提取率的影响

由图3可知，适当延长提取时间可提高单宁的提取率，但随着时间的延长，单宁提取率的提升逐渐平缓，因此，应选择合适的提取时间进行提取以提高效率。

2.2.3 提取温度的考察

取干燥新鲜柿叶1 g，以水为提取溶剂，料液比为1∶30，提取时间为1.0 h，提取1次，以提取温度分别为室温29、40、60、80、100 ℃时测得的单宁质量分数作为评价指标（见图4）。

图4 提取温度对柿叶单宁提取率的影响

由图4可知，温度对单宁提取率的影响较大，较高的温度对单宁的提取有利。但由于单宁的化学性质较为活泼，在高温下易发生化学反应，因此，应在适当的温度下进行提取。

2.2.4 料液比的考察

取干燥新鲜柿叶1 g，以水为提取溶剂，在60 ℃条件下提取1.0 h，提取1次，以料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50时测得的单宁质量分数作为评价指标（见图5）。

图5 料液比对柿叶单宁提取率的影响

由图5可知，随着浸提液的增加，单宁的提取率先提升后趋于平稳，在一定料液比下，大部分有效成分被完全提取，因此，应选取合适的料液比以免造成浪费。

2.2.5 提取次数的考察

取干燥新鲜柿叶1 g，以水为提取溶剂，料液比为1∶30，在60 ℃条件下提取1、2、3、4、5次，测得单宁质量分数作为评价指标（见图6）。

由图6可知，并非提取的次数越多越好，提取3次之后，单宁提取率的提升幅度减小，说明大部分单宁已被提取，因此，从效率方面考虑，应提取3次。

图6 提取次数对柿叶单宁提取率的影响

2.3 正交试验法优化提取工艺

根据单因素试验结果，确定单宁提取率的影响因素主要为提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C），建立因素水平表L9（34）（见表1），以单宁质量分数和出膏率为评价指标进行正交试验，结果如表2所示。

表1 因素水平

表2 正交试验结果

结合正交试验的分析结果以及单因素试验结果可知，柿叶单宁提取率影响因素的主次顺序为料液比、提取温度、提取时间，柿叶单宁的最优提取工艺：在100 ℃下提取1.0 h，料液比为1∶30，提取次数为3次。

2.4 验证性试验

在最优提取条件下进行3次平行试验，单宁平均质量分数达到27.43 mg/g，出膏率为16.57%，证明了结果的可靠性。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度

精确吸取质量浓度为0.025 3 mg/mL的标准品溶液 1.0 mL，按2.1.3的方法操作，在765 nm下连续测定6次吸光度，结果依次为0.374、0.374、0.374、0.374、0.375、0.375，相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）为0.14%，表明该仪器精密度良好。

2.5.2 重复性

在100 ℃条件下，以1∶30的料液比提取1 g干燥落柿叶 1.0 h，平行提取6次，按2.1.3的方法操作，在765 nm下测定，计算单宁的平均质量分数为13.31 mg/g，RSD为1.90%。

2.5.3 稳定性

取干燥落柿叶的提取液1.0 mL（制备方法见2.1.4），室温下分别放置0、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0 h后，按2.1.3的方法操作，在765 nm下测定吸光度，结果依次为0.633、0.633、0.635、0.635、0.636、0.638，RSD为0.30%，表明提取液在 6.0 h内的稳定性良好。

2.5.4 加样回收率

精确吸取已知质量浓度的提取液，随后加入没食子酸对照品溶液，按2.1.3的方法操作测定吸光度，按公式“加样回收率=（测得量-原质量）/加样量×100%”计算加样回收率，结果如表3所示。由表3可知，加样回收率均在95.00%～105.00%，可见该方法的系统误差较小。

表3 加样回收率试验结果

3 讨论

柿叶中的单宁具有抗氧化、抗衰老等作用，常被用于美容制品中，柿叶中单宁的提取率直接影响美容制剂的使用效果。本研究通过单因素试验及正交试验探讨了柿叶单宁的提取工艺，结果发现，柿叶单宁提取率的影响因素主次顺序为料液比、提取温度、提取时间。其中，提取时间并非越长越好，在长时间的高温下进行提取，柿叶中的单宁成分会发生一些不可逆的化学反应，例如氧化、降解等。基于这一点，可以通过增加提取次数来提高单宁的提取率。

在对单宁质量分数进行测定时，显色时间以及显色温度对最后结果的影响较大，因此，要严格控制显色条件，使结果更加准确。

在本试验的最优提取条件下，单宁平均质量分数达到27.43 mg/g，出膏率为16.57%，高于其他多数研究中的单宁提取率[5-8]。

综上所述，本试验的提取方法操作简单便利、提取率高，有利于将来对柿叶单宁的研究以及开发利用。