丝素蛋白水凝胶的研究现状与分析

汪 涛，李雨琦，陈 浩

（1.苏州大学 纺织与服装工程学院，江苏 苏州 215123；2.现代丝绸国家工程实验室，江苏 苏州 215123）

1 丝素蛋白简介

蚕丝蛋白是一种基于蛋白质的天然聚合物，凭借生物相容性、出色的机械性能以及遗传序列的可控性等优势在物理、化学领域占有重要地位。脱胶蚕丝及再生丝素蛋白（Silk Fibroin）产品获得美国食品和药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）的批准以来，大大促进了丝素蛋白生物材料及其医疗器械产品的开发。丝素蛋白的主要构型是Silk I、Silk Ⅱ与Silk Ⅲ结构[1]。Silk I是具有锯齿形的无定形构象的亚稳态结构，属于正交晶系，由于存在大量随机线圈和α-螺旋，Silk I的结晶度最低，具有不稳定性和水溶性。Silk Ⅱ（β-折叠与β-转角）作为反平行的β-折叠构象，属于单斜晶系，且具有最高的结晶度，因此具有稳定性、水不溶性、耐热性和机械性。Silk Ⅲ是具有三重螺旋晶体的独特多晶型结构，即具有亚稳态结构，结晶度介于Silk I和Silk Ⅱ之间。丝素蛋白分子具有交替排列的亲水链（Tyr、Ser）和疏水链（Gly、Ala），晶体区域主要由甘氨酸-X重复组成，其中，X是丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸，在这些域中，存在富含甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和酪氨酸的亚域[2]，如图1所示。虽然丝素蛋白黏度低、缺少RGD序列，但具有可控制的降解性、多种胶凝过程、可自组装、细胞友好性与体内生物相容性等优点，丝素蛋白水凝胶可以模仿组织和器官细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）。

图1 丝素蛋白分子链示意

基于蛋白纤维的可延展性和韧性，蚕丝有着优异的力学性能，甚至优于弹性蛋白和凯夫拉尔纤维。这种优越的特性赋予了蚕丝制备的丝素蛋白水凝胶出色的机械强度，因此，可以克服其他天然聚合物制备水凝胶时经常遇到的一些局限性问题。另外，对基于丝素蛋白的水凝胶进行改性，通过化学序列和嵌段长度修饰调整结晶度，并与不同的材料进行物理混合，可以控制其功能和性能，使其成为特定生物医学应用的良好选择[3]。丝素蛋白的应用很广泛，如凝胶、海绵、导管、微球、薄膜、纤维等[4]，如图2所示。

图2 丝素蛋白的材料应用形式

和其他生物材料（例如胶原蛋白和聚乳酸）相比，丝素蛋白在组织中的炎症反应更弱。在强度方面，蚕丝优于常用的聚合物可降解生物材料，例如胶原蛋白和聚(L-乳酸)（PLA）：蚕丝纤维的极限拉伸强度（Ultimate Tensile Strength，UTS）为740.0 MPa，胶原蛋白的UTS为0.9～7.4 MPa，PLA的UTS为28.0～50.0 MPa。这也是丝素蛋白水凝胶得以广泛应用的原因。目前，丝素蛋白已被用于脑部软组织、皮下组织和骨骼组织等多项体内研究，具有能适应各种生物组织机械强度的灵活性。

2 丝素蛋白水凝胶的交联方式

丝素蛋白水凝胶结构和性质的完整性取决于聚合物链之间通过各种物理相互作用和化学键形成的交联，成为适合特定生物医学应用的产品。有多种方法可以帮助塑造聚合物网络，通常分为物理方法和化学方法。对于物理水凝胶而言，次级力（氢键、离子键和疏水相互作用）将聚合物网络结合在一起。聚合物链之间存在的共价键会形成网络，从而形成化学水凝胶，这些条件对防止水凝胶聚合物链溶解到液体生物环境中、控制其降解速率起到一定的作用。与其他水凝胶一样，丝素蛋白水凝胶的类型取决于聚合物链之间键的类型，分为物理交联制备的丝素蛋白水凝胶与化学交联制备的丝素蛋白水凝胶[5]（见表1）。

表1 丝素蛋白水凝胶的成胶方式

2.1 物理交联丝素蛋白水凝胶

物理交联丝素蛋白水凝胶是由丝素蛋白分子的构象变化产生的，从无规卷曲到β-折叠，意味着疏水链段的自组装。这种稳定在正常情况下是不可逆的，但是酶或氧化反应可降解这些水凝胶，通过物理诱导制备的丝素蛋白水凝胶的影响因素包括温度、pH、超声处理、剪切力、表面活性剂以及使用的阴离子试剂（例如Ca2+和K+）。

有学者通过向纤维蛋白溶液中添加柠檬酸来获得丝素蛋白水凝胶。柠檬酸凝胶制成后，在50 ℃下处理12 h。体外和体内结果证明其拥有较高的生物相容性和骨缺损修复性。酸性pH不利于细胞存活，因此，通过改变pH制备的丝素蛋白水凝胶不适合直接作为细胞载体材料。还有学者将超声处理的溶液添加到小培养皿中，并保存在37 ℃的培养箱中，目测凝胶化过程，直到凝胶呈现不透明外观并形成凝结表面。他们制备的凝胶的丝素蛋白质量分数分别为4%、8%和12%时，压缩强度约为30、100和200 kPa。此外，使用4%、8%和12%丝素蛋白水凝胶封装包埋人间充质干细胞（Human Mesenchymal Stem Cells，hMSC）。在整个研究过程中，hMSC在4%的凝胶中呈圆形，没有聚集。通过电流作用制备黏性水凝胶，切换电压正负极，成胶过程可逆，有利于形成可调黏合力。

物理交联丝素蛋白水凝胶是细胞封装的潜在候选者，因为这类水凝胶通常具有更好的细胞相容性。物理交联是一种生态友好的过程，决定了物理交联丝素蛋白水凝胶的细胞毒性较低，但物理交联水凝胶的弱力学性能和可调控性限制了其在生物医用材料领域的应用。

2.2 化学交联丝素蛋白水凝胶

丝素蛋白的化学交联可以通过非酶或酶交联剂促进官能团（例如—OH，—NH2和—COOH）之间的化学反应，在分子内和分子间形成共价键来实现。

戊二醛（GTA）是应用最广泛的化学交联剂，可以促进赖氨酸的氨基和酪氨酸的酚羟基与丝素蛋白分子的反应。但GTA的应用因细胞毒性而受到限制，特别是与天然化学交联剂[如京尼平（Genipin）和聚环氧化合物]相比。

Genipin是一种天然的交联剂，相比于GTA，Genipin的细胞毒性低得多（几乎是10 000倍），细胞增殖能力强得多（大约5 000倍）。这些特性使Genipin成为制备水凝胶的理想化学交联剂。但Genipin造价昂贵，且丝素蛋白与Genipin的反应主要与赖氨酸和精氨酸（基于蛋白质的结构）的反应有关，而赖氨酸和精氨酸的氨基酸在丝素蛋白的组成中占比较小，每种氨基酸约为0.6%，导致凝胶交联效率与稳定性不高。

辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）是一种可以催化过氧化氢（H2O2）形成超氧自由基的酶，而超氧自由基可以催化丝素蛋白分子内酪氨酸之间形成双亮氨酸和三酪氨酸结合体，从而交联丝素蛋白分子，已被用作酶催化的交联剂，以促进丝素蛋白中共价交联的形成，制备丝素蛋白水凝胶。这种方法所得水凝胶显示出高弹性和可调的刚度，但HRP作为外源性活性酶制剂，进入体内引起的生理反应并没有研究透彻，因此暂时未被FDA批准。

3 展望

如果能找到一种可以稳定交联丝素蛋白的交联剂，得到一种交联效率高、机械性能良好且有一定生物相容性的丝素蛋白水凝胶，就能为丝素蛋白水凝胶在组织填充剂领域的研究和产品开发提供理论方法和实验技术指导。