蒙药蓝刺头对去卵巢大鼠TGF-β1、BMD及子宫组织形态的影响*

赵 军，李 昕，刘 晋，王雄耀，师建平△，董重阳，常 虹，高小明，莫日根，谢静华

1内蒙古自治区中医医院，内蒙古 呼和浩特010020；

2内蒙古医科大学附属医院；3内蒙古医科大学中医学院

原发性骨质疏松症按照其成因可分为Ⅰ型和Ⅱ型，其中Ⅰ型骨质疏松症由于雌激素缺乏而多发生于绝经后5～10年的女性，所以也叫绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMOP）。雌激素替代疗法（estrogen replacement therapy，ERT）防治该疾病费用昂贵，易出现高血凝状态、高血压、水肿等副反应，且长期使用可增加子宫癌及乳腺癌的发病率［1］。为此，人们在致力于寻求雌激素替代物，这类物质被称作选择性雌激素受体调质，而植物雌激素正是其中之一。流行病学调查发现，人类激素相关性疾病低发区与食富含植物雌激素的人群成正比，且植物雌激素副作用较小，对围绝经期综合征、心血管疾病及骨质疏松有保健和治疗作用［2］。研究显示［3-4］，蒙药蓝刺头具有植物刺激素样作用，可通过雌激素样作用促进骨形成，骨吸收、降低骨转换率，延缓绝经后骨量丢失的发生发展，以此达到防治PMOP的作用。本研究就蓝刺头对去卵巢大鼠血清转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、骨密度（bone mineral density，BMD）、子宫组织病理学变化的影响进行研究，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器蒙药蓝刺头制剂由广州中医药大学技产业园有限公司提供，产地：新疆乌鲁木齐市天山区；采摘时间：2018年7月。强骨胶囊（北京岐黄制药有限公司，批号：20181103，规格：0.25 g/粒）；己烯雌酚片（合肥久联制药有限公司，批号：20181004，规格：0.5 mg/片）。TGF-β1ELISA试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）；苏木素-伊红染液；5%碱性美蓝溶液；亚甲基蓝染液；PBS缓冲液；盐酸；氨水；酒精。JA503型1/1 000电子称（凯丰集团有限公司）；ACS-H1型电子计重称（上海海康电子仪器厂）；低速离心机（北京医用离心机厂出品，3000 r/min）；冰箱（内蒙古医科大学病理学实验中心提供）；SZX19型Olympus显微镜（100倍，日本奥林巴斯公司）；图像分析仪（清华同方Motic Image Advanced 3.0）；Micro-CT（内蒙古医科大学附属医院实验研究中心）。

1.2 实验动物4月龄雌性Wistar大鼠，77只，平均体质量（250±20.00）g，购于内蒙古大学实验动物研究中心，动物实验合格证号：SCXK（蒙）2002-0001。内蒙古医科大学基础实验楼病理学实验室，大鼠为清洁级，饲养条件一致，标准饲料喂养，恒温、恒湿，室温（25±3）℃，空气湿度55%～65%，自然光照、通风良好、自由进食水，养于专用鼠笼内，每笼11只，购回适应环境7天左右。

1.3 分组与造模将77只大鼠随机平均分为蓝刺头高、中、低剂量组，强骨胶囊组，乙烯雌酚组，模型组，假手术组7组，每组用亚甲基蓝染液分别编号1～11。绝经后PMOP模型的复制参考文献［5］进行，假手术组不切卵巢只切除卵巢周围少量脂肪，造模缝合创口后5天，将大鼠阴道脱落细胞涂片［6］进行观察。假手术组大鼠阴道涂片充满有核细胞、白细胞和角质化细胞，而PMOP模型组中很少见上述细胞，表明造模成功。见图1。

图1 光镜下雌鼠阴道涂片（HE×400）

1.4 给药及处理正常饲养90天后进行药物干预灌胃给药。蓝刺头高、中、低剂量组依据人、鼠体质量比例及人、鼠代谢速率比折算后分别以27.500 0、13.750 0、6.875 0 mg/mL的剂量灌胃给药，以低剂量组为临床等效剂量。强骨胶囊23.437 5 mg/mL，己烯雌酚0.031 3 mg/mL，均按成人剂量的有效量给药；用相应体积的0.9%氯化钠溶液对模型组和假手术组进行灌胃。为了便于方便配药，换算为按大鼠体质量灌胃0.02 mL/（g·d），配制成相应的浓度。灌胃过程中每组死亡2只。处死前1天停止给食，处死时腹腔注射10%水合氯醛0.8 mL麻醉，然后心内取血，采血约6～10 mL离心管内，采用3000r/min离心5 min后分离血清，进行血清TGF-β1，检测；处死大鼠剖取双侧完整股骨，分离干净附着的肌肉组织，保留完整骨膜，将股骨标记清楚，将右侧股骨用来测定离体BMD水平；大鼠子宫用4%甲醛溶液浸泡，室温保存10天，HE染色观察。

1.5 观察指标

1.5.1 骨组织计量学测定 采用显微CT对所有大鼠右侧股骨BMD计量学指标进行分析。

1.5.2 测定血清TGF-β1水平 采用酶联免疫法检测血清TGF-β1表达水平，实验步骤完全按TGFβ1试剂盒说明书操作步骤进行。

1.5.3 子宫病理学观察 常规包埋、HE染色。每组大鼠取5张切片（n0），每张切片随机选择5个视野（n1），在光学显微镜下观察各组染色情况，采用医学图像分析系统，测定镜下细胞：1）子宫内膜上皮细胞高度；2）子宫内膜腺上皮细胞高度；3）腺腔内径；4）宫内膜腺体面积百分比；5）肌全层。

1.6 统计学方法采用SPSS 13.0统软件计进行数据统计分析，计量资料用±s表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨组织计量蓝刺头中剂量组，乙烯雌酚组，强骨胶囊组，假手术组与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；蓝刺头高、低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；蓝刺头高、低剂量组与假手术组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；蓝刺头中剂量组、己烯雌酚组、假手术组、强骨胶囊组组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠BMD水平比较（±s） g/cm

表1 各组大鼠BMD水平比较（±s） g/cm

注：*表示与模型组比较，P＜0.05；△表示与假手术组比较，P＜0.05

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2.2 血清TGF-β1水平大鼠血清TGF-β1模型组与假手术组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；蓝刺头中剂量、己烯雌酚组、强骨胶囊组与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；蓝刺头高、低剂量组与模型组比较，无明显差异（P＞0.05）；蓝刺头高、低剂量组与假手术组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；蓝刺头中剂量组、己烯雌酚组、强骨胶囊组、假手术组组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清TGF-β1水平比较（±s）ng/mL

表2 各组大鼠血清TGF-β1水平比较（±s）ng/mL

注：*表示与模型组比较，P＜0.05；△表示与假手术组比较，P＜0.05

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2.3 大鼠子宫病理学变化大鼠子宫全肌层观察结果显示：假手术组内膜层较去卵巢组厚，内膜内腺腔明显，全肌层明显增厚，细胞饱满，排列致密。模型组子宫较假手术组明显缩小，内膜层薄，内膜上皮及腺体上皮较假手术组明显变薄，腺腔直径较假手术组缩小甚至不明显，全肌层明显变薄，细胞缩小，排列松散。见图2。

图2 假手术组、PMOP模型组大鼠子宫各部位病理学变化（HE×400）

子宫内膜上皮细胞高度、子宫内膜腺上皮细胞高度、腺腔内径、宫内膜腺体面积百分比，假手术组、蓝刺头中剂量组与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；蓝刺头中剂量组、强骨胶囊组、己烯雌酚组、假手术组与蓝刺头高、低剂量组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；蓝刺头高、低剂量组与模型组比较，无统计学差异（P＞0.05）；蓝刺头中剂量组、强骨胶囊组、己烯雌酚组、假手术组组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组大鼠子宫各项指标比较（±s）

表3 各组大鼠子宫各项指标比较（±s）

注：*表示与模型组比较，P＜0.05；△表示与假手术组比较，P＜0.05

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3 讨论

骨质疏松症属蒙医经典文献中“骨枯症”范畴。蒙医理论认为，骨在五元中属于土，是“赫依之寓所”，也是“赫依”病变串行之道，易发生骨折等的原因为气血相搏、精华与糟粕分解功能减弱，“肾气虚弱，精华不足”是骨质疏松症主要病机。

研究显示，蒙药蓝刺头有植物雌激素样作用，可通过雌激素样作用而促进骨形成，调节骨吸收与骨形成的偶联，降低骨转换率，达到防治PMOP的目的［7-8］。蓝刺头可通过降低去卵巢大鼠的骨高转换率，抑制骨吸收，调节骨吸收-骨形成偶联，防止骨量快速丢失，以延缓绝经后骨量丢失的发生发展，以此达到防治PMOP的目的［4］。TGF-β1作为在骨基质内含量最高的细胞因子，对骨重建发挥重要作用。它能促进骨细胞的增值分化及细胞外基质的合成，并促使成熟的破骨细胞发生凋亡［9］。子宫质量、组织形态变化是体内雌激素变化最灵敏的指标，还表现在雌性大鼠的阴道上皮角化等。BMD是诊断骨质疏松的“金标准”。

本实验中，大鼠血清TGF-β1、BMD、子宫组织病理学变化，蓝刺头中剂量组在BMD、TGF-β1及子宫病理性改变上与强骨胶囊组，乙烯雌酚组及假手术组相当。说明蓝刺头适当的剂量能有效防治因雌激素减少而导致的骨质疏松，提高血清TGF-β1及BMD水平，在骨组织形态学结构变化上，蓝刺头防治绝经后骨质疏松大鼠模型是有效的，治疗效果与强骨胶囊、己烯雌酚相似。因此，蒙医“骨枯症，补暖补精，补肾固骨质壮骨”理论与经典的雌激素通路具有密切联系，此通路是蒙医抗骨质疏松基础理论在现代医学实践中的重要组成部分。

综上所述，本研究为蓝刺头蒙医“肾主骨，治以补暖补精”理论防治PMOP提供了实验依据，但其详细的机制还需要进一步研究。