当归芍药散预处理对缺血/再灌注损伤小鼠离体子宫生理特性的影响*

彭琼琳，黄 敏，孙 敏

1鄂钢医院，湖北 鄂州436000；2十堰市太和医院/湖北医药学院附属医院

“当归芍药散”出自汉代张仲景的《金匮要略》，由芍药、当归、茯苓、川芎、泽泻及白术六味中药组成，为治疗“妇人杂病腹中诸疾痛”及“妇人妊娠诸疾痛”等妇科疾病之良药，可缓解痛经症状［1］。已有研究表明，该方可抑制子宫平滑肌收缩、松弛子宫平滑肌［2-3］。另有研究表明，该方可通过降低脑内一氧化氮含量、改善脑缺血/再灌注小鼠血脑屏障通透性并恢复脑缺血/再灌注损伤所致小鼠脾脏萎缩、显著改善小鼠的学习和记忆能力，对脑缺血/再灌注损伤具有保护作用［4-5］。因子宫肿瘤、卵巢肿瘤、产科各种手术等过程中均有可能发生生殖系统（子宫）缺血/再灌注损伤［6-7］。故研究已有药物或挖掘经典验方的可靠成分，防治子宫缺血/再灌注损伤、确保适龄孕产妇生命及生殖安全，已应成为目前妇产科医师的重要工作之一。本研究以中医学经典方剂“当归芍药散”为研究对象，重点观察和分析其对子宫缺血/再灌注损伤模型小鼠子宫生理特性的影响，并分析可能机制，为临床医师治疗该类疾病提供理论参考依据，现将结果报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级小鼠共60只，雌性，体质量18.0～20.0 g，由湖北省医学实验动物繁育中心提供，饲养于鄂钢医院科研中心标准实验室，实验室设施合格证：SYXK（鄂）2017-031，实验动物质量合格证：SCXK（鄂）2017-020。按3 R原则给予实验动物动物福利：给予人道关怀、自由进食和饮水、动物饲养间保持22～24℃、相对湿度保持65%～75%并12 h交替照明。

1.2 试剂与仪器戊巴比妥钠（北京化学试剂公司，批号：060222）；线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性测试盒（上海哈灵生物科技有限公司，批号：HL-C-C300）；BW-MD3000型生物信号采集系统（上海软隆科技发展有限公司）；iCE 3300 AAS型原子吸收光谱仪（赛默飞世尔科技）；721型分光光度计（上海奥析科学仪器有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 当归芍药散预处理 当归芍药散由鄂钢医院药房自制：取当归9 g、芍药30 g、茯苓12 g、白术12 g、泽泻15 g、川芎9 g，上六味、杵为散。然后加水500 mL，浸泡30 min后文火煮沸30 min，用滤纸过滤，加双蒸水调至100 mL，使药液相当于生药8.7%。因缺乏当归芍药散对小鼠的使用剂量相关文献，在开展实验前，经过预实验后参考人与动物用药体表面积换算公式，经计算得出小鼠的用药剂量约为生药8.7 mg/（kg·d）。

1.3.2 分组及给药60只雌性小鼠，采用随机数字表法均分为空白对照组，模型组，中药高、中、低剂量组，每组12只。灌胃时抓取以上各组小鼠，按每鼠每天早晚各0.5 mL灌胃，连续灌胃7天。中药高、中、低剂量组分别给予当归芍药散17.4、8.7、4.35 mg/（kg·d）剂量的药物灌胃，空白对照组和模型组均灌胃给予等体积生理盐水作对照，预处理后2 h手术建立子宫缺血/再灌注损伤动物模型。

1.3.3 模型制备 除空白对照组外，其余各组小鼠用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，固定、手术区域剃毛、消毒下腹部至耻骨联合处皮肤后纵形切开皮肤和腹白线，打开腹腔暴露小鼠膀胱，子宫在膀胱下，呈粉红色Y型结构。抽取500 U的肝素钠注射液，从大隐静脉注射0.1 mL，分离小鼠腹腔动脉和髂总动脉并在两者交叉处以上0.5 cm处用无创微动脉夹夹闭腹主动脉，阻断子宫血供30 min，然后松开无创微动脉夹恢复血液供应，再灌注60 min，关闭腹腔即可成模［8］。再灌注2 h游离左右两侧子宫角，在阴道与子宫汇合处剪断（注意不要摘取阴道部分），然后将左右2条子宫置于4℃的95%O2和5%CO2饱和乐氏液中备用。

1.4 观察指标

1.4.1 采用紫外分光光度法检测复合体Ⅰ～Ⅳ 取右侧10 mg子宫组织，严格按试剂盒说明书操作，步骤如下：加入1 mL试剂一、10 μL试剂三，研磨后制成组织匀浆液、加入离心管，将离心力调到3000 r/min，离心5 min。取上清50 μL，分别加入200 μL试剂二及2 μL试剂三后超生波破碎，编号保存待测。将721紫外分光光度计预热30 min，波长设定340 nm，蒸馏水调零。37℃孵育5 min，然后取40 μL加入比色皿比色，根据吸光值A1和A2计算样本吸光度值（ΔA），线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ计算公式：ΔA=A1-A2［9］。Ca2+浓度采用原子吸收光谱法，检测时取10 mg子宫组织，火焰法烧灼，研碎，加10 mL双蒸水混匀，用iCE 3300 AAS原子吸收光谱仪检测Ca2+浓度。

1.4.2 子宫生理特性指标 取左侧子宫，用眼科剪将两端修剪45°角以利于灌流时药物成分进行子宫管腔内，平滑肌条长度以3 cm为宜，两端用丝线捆好并分别与传感器和灌流槽通气钩固定，然后置于95%O2和5%CO2的饱和乐氏液的灌流槽中，灌流槽温度调到32℃，传感器与BW-MD3000生物信号采集系统相连，通气钩通95%O2和5%CO2混合气体并调整到5个气泡/min，给子宫平滑肌条加1 g前负荷平衡30 min后开始实验。实验时用加样器准确吸取0.2 U的缩宫素100 μL，加入灌流槽内使子宫平滑肌条出现节律性舒缩，记录子宫平滑肌条收缩力和收缩频率，其中张力变化取每次收缩所达到的峰值，以（g）表示，收缩频率取子宫平滑肌每分钟收缩的次数，以（次/min）表示，根据收缩力和收缩频率计算子宫活动力［收缩力×收缩频率（g·次/min）］［10］。子宫活动力为子宫生理特性的重要观察指标，其数值越大，对药物如缩宫素、崔产素或体内激素越敏感，说明子宫的生理功能越活跃。

1.4.3 氧化应激指标 取小鼠离体子宫平滑肌条10 mg，研磨后制成组织匀浆液，4℃、离心半径10 cm，4000 r/min，离心15 min，取上清液严格按试剂盒说明书，采用可见分光光度法在520 nm处检测乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）。采用黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），采用硫代巴比妥酸法检测丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。

1.5 统计学方法采用SPSS 17.0统计分析软件进行数据分析，计量资料以±s表示，采用t检验或LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 线粒体呼吸链酶复合体指标模型组和中药低剂量组离体子宫平滑肌线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ均明显升高，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；中药低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。中药中、高剂量组线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ变化呈剂量依赖性，其含量明显降低，与模型组和中药低剂量组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），且中药中、高剂量组组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组线粒体呼吸链酶复合体指标比较（±s） nmol/L

表1 各组线粒体呼吸链酶复合体指标比较（±s） nmol/L

注：a表示与空白对照组比较，P＜0.05；b表示与模型组比较，P＜0.05；c表示与中药低剂量组比较，P＜0.05；d表示与中药中剂量组比较，P＜0.05

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2.2 子宫平滑肌生理特性指标模型组和中药低剂量组收缩力、收缩频率、Ca2+浓度及子宫活动力均升高（P＜0.05），与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；中药低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。中药中、高剂量组收缩力、收缩频率、Ca2+浓度及子宫活动力均低于模型组和中药低剂量组（P＜0.05），中药高剂量组变化较中剂量组更明显，变化呈剂量依赖性，且两组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组子宫平滑肌生理特性指标比较（±s）

表2 各组子宫平滑肌生理特性指标比较（±s）

注：a表示与空白对照组比较，P＜0.05；b表示与模型组比较，P＜0.05；c表示与中药低剂量组比较，P＜0.05；d表示与中药中剂量组比较，P＜0.05

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2.3 氧化应激指标模型组和中药低剂量组SOD水平明显降低，MDA、LDH则明显升高，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；中药低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。中药中、高剂量组SOD水平明显升高，MDA、LDH则明显降低，SOD、MDA和LDH均接近空白对照组水平，且与模型组和中药低剂量组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；SOD、MDA、LDH变化呈剂量依赖性，中药中、高剂量组组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 各组氧化应激指标水平比较（±s）

表3 各组氧化应激指标水平比较（±s）

注：a表示与空白对照组比较，P＜0.05；b表示与模型组比较，P＜0.05；c表示与中药低剂量组比较，P＜0.05；d表示与中药中剂量组比较，P＜0.05

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3 讨论

当归芍药散为《金匮要略》记载的著名方剂，该方偏重于妇科止痛。适用于妇人腹痛，对辨证属阴证、虚、寒、瘀血的原发性痛经、绝经期前妇女的镇痛作用明显，并可明显缓解子宫痉挛性疼痛［11］。实验发现，当归芍药散对经麦角新碱、缩宫素、乙酰胆碱或普萘洛尔等灌流离体子宫平滑肌条均具有浓度依赖性缓解痉挛的作用［12］。在对围绝经期模型大鼠的研究中发现其具有增加子宫腺体数量的作用，这一作用可调节子宫腔上皮及基质中ERβ表达水平，为治疗围绝经期综合征提供了理论依据［13］。还可用于治疗慢性盆腔炎、羊水过多等［14-15］、子宫内膜异位症、卵巢巧克力囊肿［16］、子宫肌瘤等［17］。

应激反应是机体应对强烈有害刺激引起的一种非特异性紧张状态，是机体逃避有害刺激的正常反应。而缺血/再灌注后也会产生类似的反应——氧化应激反应，但这种反应属病理性反应，会造成组织器官损伤。研究表明，缺血本身不是缺血/再灌注损伤的主因，而是组织器官在恢复血液供应后，缺血/再灌注组织产生过量的自由基攻击重新获得血液供应的细胞而发生的病理损伤过程，故这一现象又名组织缺血/再灌注损伤。目前在子宫肿瘤、有创检查、正常分娩、子宫破裂、胎盘早期剥离、引产、流产和剖宫产等的临床研究中，发现有部分患者会出现生殖系统缺血/再灌注损伤，并因此造成严重的子宫损伤性后遗症，严重影响患者生命及生殖健康［18］。因此，防治子宫缺血/再灌注损伤的重点应为及时恢复组织血流、减轻血液复流后氧化应激反应这一重要环节，而如何干预这一环节也是目前研究的热点和难点。本研究用当归芍药散干预性治疗，发现与模型组比较，当归芍药散预处理的中、高剂量组离体子宫收缩力、频率、子宫活动力均明显降低，并恢复到空白对照组水平，反映缺血/再灌注后氧化应激反应的LDH、MDA明显降低，SOD则明显升高，说明线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及与细胞收缩相关的重要离子Ca2+浓度均明显降低并恢复到空白对照组水平，且这种效应存在剂量依赖性，高剂量组以上作用较中剂量组更加明显。这一作用说明当归芍药散预处理对子宫缺血/再灌注损伤具有保护作用。本研究证实，当归芍药散预处理可抑制线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的活性，这有利于将细胞代谢维持在一个较低的水平，降低子宫术后缺血/再灌注后子宫的进一步损伤。子宫的兴奋性有赖于细胞内外Ca2+和K+水平的平衡，当Ca2+通道开放后，K+外流、Ca2+内流，子宫平滑肌兴奋性增强、收缩力增强。缺血/再灌注损伤的离子基础为Ca2+通道开放过多，Ca2+内流过多导致细胞内外Ca2+和K+水平失衡。当归芍药散可能作用于这一环节来抑制Ca2+通道，使K+外流和Ca2+内流减少，子宫平滑肌兴奋性降低。故实验中观察到离体子宫收缩力、频率、子宫活动力均明显降低并恢复到空白对照组水平，这有利于减轻缺血/再灌注后产生的氧化应激反应，其直接结果是引起LDH、MDA明显降低、SOD则明显升高。

从实验结果来看，归芍药散可能通过抑制线粒体呼吸链酶这一细胞能量代谢途径，阻碍Ca2+内流而降低离体子宫平滑肌对缩宫素的敏感性，这会使子宫活动力降低，在一定程度上促进了缺血/再灌注子宫生理功能的恢复。