营心宁胶囊通过MEK1调控肝X受体促进动脉粥样硬化斑块稳定与消退的机制*

廖艳林，朱 浩，朱根源，张 鹏

武汉市中医医院，湖北 武汉430014

动脉粥样硬化是一种具有脂质代谢紊乱的慢性炎症性疾病［1］。其病变主要累及大、中动脉。脂质沉积在动脉内膜，产生炎症反应，纤维化和钙化形成动脉粥样硬化斑块，导致动脉腔狭窄和血管壁硬化。肝X受体是（liver X receptors，LXR）由配体（激动剂）激活的转录因子［2］，它含有LXRα和LXRβ两种异构体，分别于1994年和1995年被发现。LXRα和LXRβ的异构体在顺序和结构上高度相似。LXRα主要表达于肝脏、肾脏、小肠、脂肪组织、巨型睡眠细胞、脾脏和肺脏，LXRβ主要表达于所有组织和器官。两者之间的配体结合能力没有差异。LXR的生物学功能主要体现在胆固醇和脂肪的合成和代谢上。LXR激活一系列与胆固醇和脂肪合成与代谢有关的基因。LXR信号通路可显著增加ABCA1和ABCG1的表达，从而增加胆固醇逆向转运和LXR的抗炎作用。LXR配体在动脉粥样硬化的治疗中具有潜在的临床应用价值。营心宁胶囊主要成份为丹参、槐花、川芎、三七、红花、降香、赤芍，具有理气止痛，活血化瘀之效。用于气滞血瘀所致胸痹，症见胸闷、胸痛、心悸、气短。大量研究证实，该药除可降低血压外，还可通过益气化痰，起到降低血脂及多种炎症因子水平的作用，进而对动脉产生保护，而全身动脉粥样硬化的发生发展与高血压、高血脂及炎症因子水平密切相关［3-5］。

1 材料与方法

1.1 实验动物50只雌性C57BL/6（8周龄）小鼠，99只雌性ApoE-/-小鼠（24只制备胆固醇反向转运分析，75只进行高脂饲料喂养），均购自上海亓上生物医学科技有限公司，实验动物合格证号：SCXK（沪）2021-0004。饲养条件：小鼠自由获得维持饲料。在进入实验周期后，将预先配置好的食物粉放入小鼠饲养瓶中，根据小鼠体质量给予食物。每只小鼠的摄食量约为体质量的10%～15%。根据每个笼子中小鼠的数量，每2天更换新鲜食物，称小鼠体质量。

1.2 试药及仪器营心宁胶囊（贵阳新天药业股份有限公司，批号：14000444136，规格：0.38 g/片）；高脂饲料（上海睿安生物科技有限公司，批号：310109004）；RPMI1640培养基（上海碧云天公司，批号：2018-AA5289）；总胆固醇（total cholesterol，TC）检测试剂盒（上海碧云天公司，批号：2019-DB1125）；低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒（上海碧云天公司，批号：2018-PO3620）；高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒（上海碧云天公司，批号：20199-BC0027）；血清甘油三酯（triglyceride，TG）检测试剂盒（上海碧云天公司，批号：2019-AS2955）；天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）检测试剂盒（上海碧云天公司，批号：2019-XZ1129）；谷氨酸氨基转移酶（alsnine aminotransferase，ALT）检测试剂盒（上海碧云天公司，批号：2019-HB1029）；RT-1000型RT-PCR实时定量系统（南京中科拜尔医学技术有限公司）。

1.3 C57BL/6小鼠实验

1.3.1 分组及处理 将50只雌性C57BL/6（8周龄）小鼠随机分为空白对照组，模型组，营心宁胶囊低、中、高剂量组，每组10只。模型组及营心宁胶囊低、中、高剂量组以营心宁胶囊添加量为0、1、3、9 mg/100 g的高脂饲料（21%脂肪，0.5%胆固醇）喂养2周；空白对照组喂以普通饲料。

1.3.2 腹腔巨噬细胞的提取C57BL/6小鼠8周龄时，每只小鼠腹腔注射3 mL 4%的赖氨酸乙酯。用普通饲料喂养5天后用颈椎脱臼法处死小鼠。用剪刀切开腹部，完全暴露腹膜。腹腔内注射7 mL无菌的1×PBS，腹腔液吸入50 mL离心管内。离心半径15 cm，1500 r/min离心10 min，收集腹腔巨噬细胞。在含有10% FBS的RPMI1640培养基中悬浮。1 h后更换新鲜培养基，培养2天后，更换培养基并进行药物处理。

1.3.3 脏器组织采集 取C57BL/6（8周龄）小鼠肝脏、脾脏、肾脏、小肠和淋巴结。部分用4%聚甲酸切片固定组织，其余80℃保存。收集小鼠血清并进行生化指标测定。

1.3.4 全动脉油红O染色 在解剖显微镜下仔细解剖C57BL/6（8周龄）小鼠主动脉外脂肪和其他粘连的主动脉组织。将主动脉置于1 mL聚甲酸溶液中固定24 h以上，将整个主动脉置于24孔板中的一个孔中。加入1 mL油红O工作液，染色40～60 min。过量的染色液用60%异丙醇洗涤，直到部分主动脉变白和半透明，斑块区域明显变红。然后用蒸馏水冲洗3次。在显微镜下对主动脉进行再检查，除去在主动脉外染色的脂肪组织。显微镜下拍照并保存照片。用PS图象处理软件计算斑块面积和主动脉总面积，计算斑块面积比例。

1.3.5 LXR表达量 通过q-RT-PCR对LXR mRNA表达量进行测定。利用总RNA快速提取试剂盒提取总RNA，并使用miRNA特有的逆转录引物，将其与Super M-mLV逆转录酶进行反向转录。RT-PCR是在实时定量系统中上进行。

1.3.6 生化指标 室温下对C57BL/6小鼠进行眼球取血，静置2 h，2000 g离心20 min，取上清液。将血清用PBS稀释至一定倍数。对标本进行血清生化指标TC、TG、AST、ALT的检测。

1.4 ApoE-/-小鼠小鼠实验

1.4.1 分组及处理 选用8周龄雌性ApoE-/-小鼠24只，随机分为对照组和营心宁低、中、高胶囊组（U0：3 mg/100 g食物），每组6只。小鼠以正常食物喂养2周，在喂养的第9天，制备一组新的8周龄ApoE-/-小鼠，每只小鼠腹腔注射4%硫凝胶，第5天取出巨噬细胞后，裂解红细胞。计数巨噬细胞并稀释至2 mL无血清培养基中，加入最终浓度为50 ng/mL的clLDL和2 μCi/mL［3H］-胆固醇，37℃，CO2培养箱中标记24 h。4组小鼠腹腔注射标记细胞，每组注射2×l06细胞。注射后8、24、48 h收集小鼠粪便标本。48 h后处死小鼠，收集血清、腹腔巨大温血细胞和肝组织。提取样品中的脂质成分，用液体闪烁检测器检测各样品中的3H放射性。

1.4.2 动脉粥样硬化斑块分析 采用高脂饲料喂养75只雌性ApoE-/-小鼠12周，随机分成G1、G2、G3、G4、G5组，每组15只。使其动脉粥样硬化发展到中期，然后用药物和改良的食物配方进行治疗。G1组高脂饲料喂养12周后取血清、主动脉、肝脏等标本；G2组高脂饲料连续喂养4周；G3组高脂饲料中添加营心宁胶囊（3 mg/100 g饲料）；G4组动物喂以基本维持饮食；G5组在维持饲料中添加营心宁胶囊（3 mg/100 g饲料）。4周后处死G2-G5组小鼠，收集血清、主动脉、肝脏、腹腔巨噬细胞等标本。

1.5 统计学方法本研究中数据采用SPSS 20.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 C57BL/6小鼠实验结果

2.1.1 血清TC、TG水平 与空白组比较，营心宁胶囊各剂量组TC水平提高（P＜0.05），与模型组比较，营心宁胶囊高剂量组TC水平显著降低（P＜0.05）。与空白组比较，营心宁胶囊各剂量组TG水平均提高（P＜0.05），与模型组比较，营心宁胶囊各剂量组TG水平均下降，且营心宁胶囊高剂量组血清中TG水平下降（P＜0.05）。见表1。

表1 各组C57BL/6小鼠血清中TC、TG及LXR水平比较（±s）

表1 各组C57BL/6小鼠血清中TC、TG及LXR水平比较（±s）

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2.1.2 LXR表达量 与空白对照组比较，模型组、营心宁胶囊低剂量组LXR mRNA表达量降低（P＜0.05），营心宁胶囊中、高剂量组LXR mRNA表达量低于空白对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.1.3 血清ALT、AST水平 与空白对照组比较，其余各组ALT、AST水平均升高（P＜0.05）；与模型组比较，营心宁胶囊各剂量组ALT、AST水平降低（P＜0.05）。见表2。

表2 各组C57BL/6小鼠ALT、AST水平比较（±s）U/L

表2 各组C57BL/6小鼠ALT、AST水平比较（±s）U/L

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2.1.4 肝脏组织病理学表现 高脂食物可以使肝脏颜色变白，表明肝脏中脂质含量的增加，LXR配体可以促进肝脏变白，营心宁胶囊可改善高脂食物所致的肝脏发白表现，表明营心宁胶囊具有改善脂肪肝的作用。见图1。

图1 各组C57BL/6小鼠肝脏组织病理学表现

2.1.5 肝脏组织油红O染色结果 肝脏冷冻切片油红O染色显示，随着营心宁胶囊浓度的增加，肝脏脂质积聚明显减少，营心宁胶囊消除了高脂饲料引起的肝脏脂质积聚，见图2。与模型组比较，营心宁胶囊各剂量组TG含量均下降，且营心宁胶囊高剂量组下降更明显（P＜0.05）。见表3。

图2 各组C57BL/6小鼠肝脏组织油红O染色结果（×200）

表3 各组C57BL/6小鼠肝脏中TG水平比较（±s）mM

表3 各组C57BL/6小鼠肝脏中TG水平比较（±s）mM

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2.2 ApoE-/-小鼠实验结果

2.2.1 动脉组织油红O染色结果 对雌性ApoE-/-小鼠主动脉组织进行油红O染色，喂养高脂饮食12周后，主动脉斑块面积约占总主动脉表面积的11%。持续喂养高脂饮食进一步加剧斑块的发展。16周后，总主动脉斑块面积约占主动脉总面积的13%左右。喂养12周后，进行干预，雌性ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的形成受到抑制。但单独改善饮食结构时，斑块的发育不受影响。低脂低胆固醇饲料喂养时，用药组小鼠的斑块面积为9%左右，12周时斑块面积小于初始面积的11%，表明用药不仅抑制动脉粥样硬化的发展，而且在粥样硬化斑块的消退中起到了一定的作用。见图3、表4。

图3 各组ApoE-/-小鼠主动脉组织油红O染色结果（×200）

2.2.2主动脉根部斑块面积 与主动脉斑块的形成相似，高脂饮食12周后主动脉根部斑块的面积约为34%，16周后增加到42%～44%。不同于整个主动脉，在高脂饮食的情况下，用药对雌性ApoE-/-小鼠有明显的抑制作用。同样，单一的饮食干预也不能阻止成熟斑块的进一步发展。然而，在健康饮食背景下，MEK1/2抑制使斑块面积下降到约29%，低于12周的初始值。见表4。

2.2.3 肝脏TG含量 在雌性ApoE-/-小鼠中，即使在高脂饮食的情况下，G2-G5组肝脏中TG积累量减少。当用正常饮食代替食物时，血清TG水平降低，肝脏TG水平低于G1组，并且用药对TG水平无明显影响。见表4。

表4 各组ApoE-/-小鼠主动脉斑块面积比及肝脏TG含量比较（±s）

表4 各组ApoE-/-小鼠主动脉斑块面积比及肝脏TG含量比较（±s）

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3 讨论

动脉粥样硬化是心脑血管疾病的主要病理基础之一［6］，动脉粥样硬化斑块的形成是主动脉血管随病情进展而发生炎症、脂质沉积、细胞坏死和纤维化的过程［7］。在细胞的分化和增殖中，ERK1/2起着重要的作用［8］。ERK1/2的活化依赖于上游激酶MEK1/2，因此，MEK1/2抑制剂是潜在的抗癌药物。

有报道［9］指出，IL-13在其诱导的肺炎症反应和重建过程中特异性激活ERK1/2。抑制ERK1/2活性可降低IL-13激活的化学因子和MMP-2、MMP-9、MMP-12、MMP-14的表达［10］，ERK1/2在TNF-α诱导的炎症反应中也起重要作用［11］。

TG是细胞中重要的能量物质［12］，机体摄入的多余的能量以TG的形式储存在肌肉和脂肪组织中［13］。有研究［14］表明，LXR能直接刺激SRBEPLc和FASN的表达，因此，LXR是调节脂质代谢的关键因素。本研究表明，与模型组比较，营心宁胶囊高剂量组血清中TC、TG水平显著下降，且高剂量营心宁胶囊可显著降低高脂食物引起的血清TC、TG水平。

当肝脏中TG代谢异常时，一方面，TG在肝脏中蓄积并引起肝脏脂肪损害［15］；另一方面，肝脏中v-LDL的合成会将TG排出循环系统，导致高TG血症［16-17］。最新研究［18］表明，TG水平的升高与动脉粥样硬化脂质颗粒和载脂蛋白Ⅱ的水平直接相关。本研究通过油红O染色对肝脏冷冻切片进行观察，结果表明随着营心宁胶囊浓度的增加，肝脏脂质积聚明显减少，营心宁胶囊消除了高脂饲料引起的肝脏脂质积聚。与模型组比较，营心宁胶囊各剂量组TG含量均出现下降的趋势，表明营心宁胶囊不会引起高TG血症、脂肪肝等副作用。

本研究发现，与空白对照组比较，模型组、营心宁胶囊低剂量组LXR mRNA表达量降低，营心宁胶囊中、高剂量组LXR mRNA表达量低于空白对照组，但差异无统计学意义。

MEK1/2抑制剂可增加巨噬细胞ABCAl和胆固醇流出物的表达，并与LXR配体有协同作用［19］。这表明MEK1/2抑制剂可以更广泛地应用于动脉粥样硬化的预防和治疗中。同时MEK1/2抑制剂可预防和治疗ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化。MEK1/2抑制剂可消除LXR配体引起的脂肪肝和肝损害等副作用［20］。本研究发现，对ApoE-/-小鼠主动脉组织进行油红O染色观察，喂养高脂饮食16周后，总主动脉斑块面积约占主动脉总面积的13%左右。喂养12周后，进行干预，雌性ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的形成受到抑制。低脂低胆固醇饲料喂养时，营心胶囊干预ApoE-/-小鼠12周时斑块面积小于初始面积的11%，表明该药不仅抑制动脉粥样硬化的发展，而且在粥样硬化斑块的消退中起到了一定的作用。与主动脉斑块的形成相似，单一的饮食干预不能阻止成熟斑块的进一步发展，在健康饮食背景下，MEK1/2抑制使斑块面积下降到约29%，低于12周的初始值。

综上所述，MEK1/2抑制剂对肝X受体动脉粥样硬化斑块稳定与消退具有促进作用。