核桃中主要过敏原Jug r 1 B细胞线性表位中 关键氨基酸的免疫信息学预测和识别

郝梦真，毕 源，宋若琳，陈 锡，车会莲

（食品质量与安全北京实验室，中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

2000年初，树坚果过敏已成为公众关注的公共卫生问题[1]，核桃过敏是常见的树坚果过敏类型。随着核桃进口贸易的不断扩大，核桃过敏问题也逐渐加剧，以韩国为例，截止到2016年核桃已成为引起韩国儿童过敏反应的第三大常见食物[2]。目前，过敏原数据库中已收录了11 种核桃相关的过敏原，包括英国胡桃中的Jug r 1、Jug r 2、Jug r 3、Jug r 4、Jug r 5、Jug r 6、Jug r 6、Jug r 8。

Teuber等[3]对英国核桃中的过敏原Jug r 1进行体外表达，发现约75%的核桃过敏患者血清可与Jug r 1识别结合，说明Jug r 1是英国核桃中的主要过敏原。Jug r 1中的抗原表位具有与过敏患者血清IgE结合的活性。Wangorsch等[4]发现，过敏原表位中某些氨基酸残基对过敏原结构稳定性和过敏原IgE结合活性有关键性作用，因此寻找过敏原表位中的关键氨基酸对认识过敏原的结构和生产低致敏性蛋白有重要意义。

目前，可使用不同的方法预测或识别过敏原表位中的关键氨基酸。免疫信息学分析是新兴的预测手段。基于目标表位中不同氨基酸的理化性质、相对频率和保守程度[5-7]，免疫信息学的方法可对目标表位中的关键氨基酸进行预测。采用免疫信息学预测表位关键氨基酸以进一步缩小表位中关键氨基酸的范围，进而降低定点突变的盲目性。然而，在表位中预测的关键氨基酸对表位与IgE结合活性的影响需进一步验证。丙氨酸扫描诱变法是研究抗原表位关键氨基酸的重要方法，即用丙氨酸依次取代作用表位的氨基酸合成新的多肽[8]，然后采用酶联免疫吸附分析法识别降低过敏原致敏性的关键氨基酸。丙氨酸是蛋白质中最简单的中性氨基酸，由于其缺乏特殊的主链二面角偏好不会使原蛋白失活，而氨基酸中结构最简单的甘氨酸由于其侧链组成简单，会使蛋白质主链具有构象灵活性。因此丙氨酸常用于氨基酸替代方法中以构建丙氨酸扫描突变体[9]。利用免疫信息学预测结合丙氨酸扫描诱变法可提高过敏原表位关键氨基酸研究可信度。

本课题组之前研究[10]已采用固相肽合成法结合斑点免疫印迹分析识别核桃过敏原Jug r 1的表位1、2、3共3 个线性表位区域，即4LVALLFVANAAA15、16FRTTITTMEIDEDID30、125CGISSQRCEIRRSWF139，依次记为Jug r 1-01、Jug r 1-02、Jug r 1-03。为分析上述 3 个线性表位区域的关键氨基酸，本研究通过2 种免疫信息学分析软件进行预测，并结合丙氨酸扫描诱变法识别 Jug r 1的线性表位中的关键氨基酸。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA） 北京索莱宝科技有限公司；96 孔聚苯乙烯酶标板 美国Costar公司；抗人IgE（ε-链特异性）-过氧物酶山羊抗体 美国Sigma-Aldrich公司；快速化学发光试剂 美国Merck公司。

1.2 仪器与设备

Varloskan Flash多功能酶标仪 美国Thermo Fisher Scientific公司；高效液相C18柱 美国Vydac公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃过敏患者血清的收集

本研究共招募10 名受试者，其中6 名为核桃过敏患者，通过病人自述摄入核桃后的症状和病史确定其对核桃存在过敏反应。患者具体信息见表1，研究目的和方法已告知所有受试者，采血过程征得了所有受试者的同意。采集的血样37 ℃孵育1 h，于4 ℃、4 000×g离心10 min，取上清液，分装编号，置于－80 ℃保存。

表1 核桃过敏患者信息Table 1 Information of walnut-allergic patients recruited for this study

1.3.2 突变肽段的合成、纯化和鉴定

根据过敏患者识别出的3 个Jug r 1的抗原表位（4LVALLFVANAAA15、16FRTTITTMEIDEDID30、125CGISSQRCEIRRSWF139）的氨基酸序列，依次使用丙氨酸进行替代，若原氨基酸序列中氨基酸为丙氨酸，则使用甘氨酸进行替代，用9-芴甲氧羰基（fiuorenylmethoxy carbony，Fmoc）固相合成法合成突变表位肽段[11]。高效液相色谱法测定的肽纯度大于95%。 合成肽分子质量通过电喷雾电离-质谱确认[12]， 于－20 ℃保存。

1.3.3 Bioedit软件对抗原表位区域的关键氨基酸的预测

采用Bioedit软件对Jug r 1蛋白序列全长的氨基酸组成和出现频率进行分析，再运用该软件对Jug r 1中的3 个抗原表位区域的氨基酸组成和出现频率进行分析。通过对比各类氨基酸分别在Jug r 1蛋白质全长和抗原表位区域出现频率的变化，预测主要活性氨基酸。

1.3.4 DNAstar软件对抗原表位区域的关键氨基酸的预测

采用DNAstar Protean软件对3 个抗原表位区域的氨基酸进行亲水性、表面可及性、柔韧性及抗原指数分析，选择抗原表位区域中同时满足4 个参数条件的氨基酸（亲水性＞0、表面可及指数＞1、柔韧性＞0、抗原指数＞0），作为预测的关键氨基酸。

1.3.5 酶联免疫吸附测试法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定突变表位肽的IgE结合能力

参考Cocco等[13]的研究方法，通过直接ELISA识别IgE作用表位和关键氨基酸。以3 个抗原表位肽为阳性对照，以未加抗原的溶剂组为阴性对照。将合成的冻干肽粉末溶于100%二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中，使其质量浓度为3 mg/mL；用配好的突变表位肽段溶液包被96 孔板，每孔100 μL，4 ℃过夜孵育后，用洗涤液PBST（1 mL吐温-20与1 000 mL磷酸盐缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS））洗涤4 次，每次3 min；加入封闭液（1.0 g BSA与100 mL PBS）在37 ℃封闭2 h，用PBST洗涤3 次，每次3 min；加入一抗反应液（过敏患者血清1∶10稀释，血清稀释液0.1 g BSA/100 mL PBS）37 ℃孵育2 h后，用PBST洗涤3 次；用生物素标记的山羊抗人IgE抗体37 ℃孵育1 h后，用PBST洗涤3 次；加入HRP标记的链霉亲和素在37 ℃孵育1 h后，用PBST洗涤6 次；加入TMB显色液，在37 ℃显色10～15 min后，加入2 mol/L硫酸溶液终止反应；用酶标仪测定其在450 nm波长处的OD值。

1.3.6 Jug r 1三级结构分析及关键氨基酸定位

在Protein Data Bank，使用BLAST搜索已知的蛋白质为模板[14]。Ber e 1与Jug r 1进行蛋白质BLAST比对发现具有约45%的相似度，符合建模标准。采用2S白蛋白的SWISS-MODEL网站中的比对模式作为模板，建立了较为准确的三维模型[15]。通过分子动力学模拟和能量最小化，得到了Jug r 1的三维模型。由于Jug r 1的N端区域与建模模板Ber e 1存在显著差异，因此在Jug r 1的模型省略此部分，而从高度相似的残基36开始。采用可视化软件RasMol查看Jug r 1线性表位和线性表位中关键氨基酸在三级结构中的位置。

1.4 数据分析

统计分析采用SPSS 17.0软件进行，所有实验均做3 次平行。使用方差分析进行数据间差异水平的分析，以Kruskal-Wallis检验置信水平，95%为显著水平。

2 结果与分析

2.1 Bioedit软件对抗原表位的关键氨基酸预测结果

采用Bioedit软件分析Jug r 1及其3 个线性表位的一级序列中各类氨基酸的出现频率，由图1可看出，在过敏原Jug r 1的整个序列中含有19 种氨基酸，缺少赖氨酸，最多的是L-谷氨酰胺（Q）和精氨酸（R）；在过敏原Jug r 1的3 个线性表位区域中含有丙氨酸（A）、半胱氨酸（C）、天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）、苯丙氨酸（F）、甘氨酸（G）、组氨酸（H）、异亮氨酸（I）、赖氨酸（K）、亮氨酸（L）、蛋氨酸（M）、天冬氨酸（N）、脯氨酸（P）、谷氨酰胺（Q）、精氨酸（R）、丝氨酸（S）、苏氨酸（T）、缬氨酸（V）、色氨酸（W）、酪氨酸（Y）共16 种氨基酸，组成全蛋白序列的酪氨酸（Y）、组氨酸（H）和脯氨酸（P）没有出现。若某种氨基酸在表位区域中的出现频率高于蛋白全长区域中的出现频率，表明该氨基酸残基在表位区域中起重要作用，其可能为关键氨基酸[16]。丙氨酸（A）、天冬氨酸（D）、苯丙氨酸（F）、异亮氨酸（I）、丝氨酸（S）、苏氨酸（T）、缬氨酸（V）、色氨酸（W）在表位区域中出现的频率高于蛋白全长区域，其极有可能为关键活性氨基酸，结合上述氨基酸在3 个线性表位出现的位置，预测6A、10V、11A、13-15A、16F、20I、26D、28D、30D、127I、128-129S、137S、138W、139F。

图1 核桃过敏原Jug r 1及其3 个线性表位区域的氨基酸分布情况Fig. 1 Distribution of amino acids in Jug r 1 and its three liner epitope regions

2.2 DNAstar软件对抗原表位的关键氨基酸预测结果

在获得Jug r 1的3 个线性表位的氨基酸序列的基础上，采用DNAstar Protean软件对其一级结构的亲水性、表面可及性、柔韧性以及抗原指数进行分析，预测4 个可能位点，结果见表1。按Kyte等[17]的氨基酸亲水性标准分析Jug r 1的3 个线性表位的亲水性，亲水性指数大于0则亲水性较理想；根据Emini等[18]分析Jug r 1的3 个线性表位的表面可及性方法，以表面可及指数大于1（即区域位于蛋白质表面）为筛选标准；按Karplus-Schulz法[19]对Jug r 1的柔性区域进行分析；根据Jameson等[20]分析Jug r 1的3 个线性表位的潜在抗原表位方法，以抗原指数大于0为筛选条件。采用DNAstar软件预测Jug r 1的3 个线性抗原表位中关键氨基酸的结果如表2所示。

表2 DNAstar软件预测Jug r 1的3 个线性抗原表位关键氨基酸Table 2 Key amino acids in three epitopes of Jug r 1 predicted by DNAstar

2.3 突变表位肽的合成及其与IgE的结合能力分析

为了研究2 种免疫信息学方法预测线性表位中关键氨基酸的准确性，确定Jug r 1的3 个线性表位中影响表位IgE结合活性的真实关键氨基酸，本实验对3 个线性表位进行氨基酸定点突变，在线性表位肽中将每个氨基酸转化为丙氨酸或甘氨酸，并通过核桃过敏患者的血清检测这些突变肽的免疫反应性。

根据之前研究[10]得到的6 名核桃过敏患者血清中特异性IgE抗体识别的抗原表位氨基酸序列，重新合成了42 个突变表位肽，结果如表3所示。

表3 突变表位肽段Table 3 Synthetic mutant epitope peptides

续表3

采用ELISA法检测Jug r 1-01、Jug r 1-02、Jug r 1-03的3 种突变表位肽段与过敏患者血清中特异性IgE抗体的结合情况，结果分别如图2～4所示，其中阴性肽段均为AAAAAAAAAAAAAAA。

图2 IgE对Jug r 1表位1的12 个突变肽的反应性分析Fig. 2 Analysis of IgE reactivity to 12 mutant peptides from epitope 1 of Jug r 1

用丙氨酸或甘氨酸依次取代Jug r 1表位1中的氨基酸合成突变表位肽，分别用6 名核桃过敏患者血清为抗体识别新合成的突变表位肽，分别以Jug r 1-01为阳性对照，以溶剂为阴性对照，测得450 nm波长处OD值如图2A所示，汇总各名核桃过敏患者血清IgE对12 个突变表位肽的反应性得图2B，以6 名核桃过敏患者血清IgE的反应性均为阴性为筛选标准，对关键氨基酸进行识别。由图2B可知，Jug r 1表位1肽段1-1、1-4、1-5对应表3中第4、7、8位的亮氨酸被丙氨酸替代（L4A、L7A、L8A）后与6 名患者血清IgE的结合活性均显著降低（P＜0.01），而该肽段上的其他氨基酸被替代后仍会出现至少1 例IgE结合阳性的情况。

运用同样的方法确定了Jug r 1表位2、表位3上的关键氨基酸，结果分别如图3A、4A所示，汇总后分别得到图3B、4B。由图3B可知，Jug r 1表位2肽段2-5、2-6、2-13对应表3中第20位异亮氨酸、第21位苏氨酸、第28位天冬氨酸分别被丙氨酸替代（I20A、T21A、D28A）后，与6 名患者血清IgE的结合活性均显著降低（P＜0.01）。由图4B可知，Jug r 1表位3肽段3-3、3-5、3-6对应表3中第127位异亮氨酸、第129位丝氨酸、第130位谷氨酰胺分别被丙氨酸替代（I127A、S129A、Q130A）后，与6 名患者血清IgE的结合活性均显著降低（P＜0.01）。

图3 IgE对Jug r 1表位2的15 个突变肽的反应性分析Fig. 3 Analysis of IgE reactivity to 15 mutant peptides from epitope 2 of Jug r 1

图4 IgE对Jug r 1表位3的15 个突变肽的反应性分析Fig. 4 Analysis of IgE reactivity to 15 mutant peptides from epitope 3 of Jug r 1

基于上述丙氨酸扫描诱变法，得到Jug r 1的3 个线性表位中影响表位免疫反应性的关键氨基酸为第4位亮氨酸、第7位亮氨酸、第8位亮氨酸、第20位异亮氨酸、第21位苏氨酸、第28位天冬氨酸、第127位异亮氨酸、第129位丝氨酸、第130位谷氨酰胺。由于线性表位1、2不在建模范围内，因此无法在空间结构上标注其关键氨基酸。仅对表位3及其关键氨基酸在蛋白质空间结构上的位置进行了标注，结果如图5所示。

图5 Jug r 1的正（A）、反（B）面三维结构Fig. 5 Front (A) and back (B) view of 3D structure of Jug r 1

3 讨 论

Jug r 1是英国核桃中的2S白蛋白，分子质量为15～16 kDa[3]。2S白蛋白被描述为坚果中的主要过敏原，如巴西坚果（Ber e 1）、榛子（Cor a 14）、开心果（Pis v 1）、腰果（Ana o 3）[21]。这种小体积的蛋白质过敏原以种子贮藏蛋白[22]的形式大量存在于许多可食用的树坚果中，并参与树坚果中的交叉反应性[23-24]。Chou等[25]发现，表位上的关键氨基酸是引起不同过敏原交叉过敏反应的原因。目前鲜见不同树坚果中2S白蛋白过敏原表位中关键氨基酸的研究，免疫信息学预测法和丙氨酸扫描诱变法为关键氨基酸的预测和识别提供技术参考。本研究对英国核桃中的2S白蛋白过敏原线性表位中的关键氨基酸识别，有利于认识其他树坚果中2S白蛋白过敏原表位和不同树坚果的交叉过敏反应。除此之外，Deus-De-Oliveira等[26]采用蓖麻子2S白蛋白过敏原Ric c31和Ric c 3的关键氨基酸阻断了肥大细胞上IgE与过敏原结合，因此过敏原关键氨基酸的鉴定可为游离氨基酸治疗变态反应提供依据。

Jug r 1的线性表位的研究始于2002年，Robotham等[27]采用20 名核桃过敏患者血清识别得到Jug r 1的1 个线性表位105GLRGEEMEEMVQS117，并鉴定其中的关键氨基酸为107R、108G、109E、110E、113E。在2009年，Sordet等[28]采用3 名核桃过敏患者血清识别了4 个线性表位，分别为6IDNPRR11、42YDEDNQRQH50、72QVVRRQQQQ80、102CGISSQRCEIRR113。毕源等[10]使用6名核桃过敏患者血清识别出3 个Jug r 1的抗原表位4LVALLFVANAAA15、16FRTTITTMEIDEDID30、125CGISSQRCEIRRSWF139，其中表位2和表位3与 文献[27-28]识别的位置不同。因此，本研究对Jug r 1线性表位中的关键氨基酸进行识别，以补充对核桃过敏原Jug r 1线性表位致敏性的认识。本研究确定的抗原表位的关键氨基酸中，亮氨酸（L）和异亮氨酸（I）均为中性疏水氨基酸，Shin等[29]发现相比极性或带电荷氨基酸，疏水性氨基酸在花生过敏原Ara h 1表位肽的突变更容易引起表位与IgE结合活性的改变。除此之外，在针对α-乳白蛋白[12]、β-酪蛋白和β-乳球蛋白[30]过敏原表位中关键氨基酸识别研究中也发现了亮氨酸和（或）异亮氨酸是线性表位中的关键氨基酸，这可能与疏水氨基酸在维持蛋白二级结构中的作用有关。除此之外，本研究还发现苏氨酸（T）、丝氨酸（S）和谷氨酰胺（Q）也是Jug r 1线性表位中的关键氨基酸，这3 种氨基酸均为极性、不带电荷的氨基酸，这类氨基酸带有极性基团，因此其比疏水氨基酸更容易溶于水，且此类氨基酸的侧链基团易形成二硫键，二硫键对于维持蛋白质结构的稳定性有重要作用。天冬氨酸（D）也是本研究识别的关键氨基酸，Fu Linglin等[7]发现天冬氨酸同样是中国对虾中原肌球蛋白和精氨酸激酶共2 种过敏原线性表位中的关键氨基酸，天冬氨酸是带负电的酸性氨基酸，增强线性表位的负电密度也可能提高肽的致敏性。

如今，免疫信息预测、氨基酸定点突变技术是预测和研究过敏原表位中关键氨基酸的重要方法。免疫信息学的预测可为表位中氨基酸定点突变节约时间、经济成本，但免疫信息学的预测标准不同会导致预测位点与实际关键氨基酸之间的差异。因此本研究使用Bioedit对Jug r 1及其3 个线性表位中氨基酸种类进行统计，通过分析各类氨基酸在蛋白和表位出现频率预测关键氨基酸的潜在种类，并结合Jug r 1的3 个线性表位的氨基酸序列预测潜在关键氨基酸位点。除此之外，本实验使用了预测B细胞线性表位常用的免疫信息学工具DNAstar，通过分析表位亲水性、表面可及性、柔韧性以及抗原指数预测Jug r 1的3 个线性表位中关键氨基酸的潜在位点。预测效率、准确率是评价免疫信息学工具预测效果的重要指标。本研究中预测效率为通过免疫信息学工具预测到真实关键氨基酸的比例，预测准确率为免疫信息学工具预测得到的潜在关键氨基酸中真实关键氨基酸所占比例。免疫信息学的预测效率高，但更容易出现假阳性的结果；预测准确率高，但更容易出现假阴性的结果。因此，在采用免疫信息学对过敏原线性表位中的关键氨基酸进行研究时，可结合后续实验目的选择合适预测效率、准确率的免疫信息学工具。例如，为降低实验的盲目性可选择预测准确率更高的预测工具，或者采用多种预测工具结合的策略。为更全面地发现过敏原线性表位中的关键氨基酸可选择预测效率更高的预测工具，以减少遗漏关键氨基酸的情况。本研究对2 种免疫信息学方法预测的关键氨基酸位点与丙氨酸扫描诱变法识别的关键氨基酸位点进行了比较，前者的预测准确率为23.53%，预测效率为44.44%，后者的预测准确性18.18%，预测效率为22.22%。这2 种免疫信息学预测方法共同筛选出的关键氨基酸为28D，采用2 种免疫信息学方法结合的方式得到的预测准确率为100%，而预测效率仅为11.11%。使用免疫信息学方法预测在提高关键氨基酸识别效率的同时，会因预测标准的不同而出现一些关键氨基酸被忽略的情况，导致对表位中关键氨基酸的识别不够全面。所以，免疫信息学预测选择的参数或标准很重要。为了提高预测性能，常结合多种过敏原特征进行综合分析，例如使用BepiPred、BCPred、SVMTriP、LBtope、 APCPred等B细胞线性表位预测工具可对过敏原线性表位进行预测[31]。这些预测工具均基于蛋白质中氨基酸的亲水性、电荷、暴露表面积和二级结构等性质展开的预测[32]， 而这些性质与抗原的免疫反应性有密切关系[33-34]，因此这些工具也可用于预测B细胞线性表位中的关键氨基酸。通过筛选同类蛋白在不同物种间的保守氨基酸也是预测过敏原关键氨基酸的方法[7]。选择不同的工具和标准进行综合分析可实现多维预测，有利于提高预测准确性，但也可能降低预测效率。免疫信息学软件分析结果与实际存在差异，因此免疫信息学软件分析结果需结合其他实验方法共同确定抗原表位的关键氨基酸。

本实验还发现，用不同患者的血清识别的关键氨基酸有所差异，例如在表位3上的第128号丝氨酸被丙氨酸替代后，1号患者血清与突变肽的结合强度未发生显著变化，而剩余5 名患者血清与突变肽的结合强度均不同程度地降低，表位中关键氨基酸与患者IgE之间的结合存在异质性[30]，且表位中关键氨基酸与IgE结合的异质性也可能导致免疫信息学预测准确度和效率的下降。因此，对于核桃主要过敏原Jug r 1线性表位的关键氨基酸仍需更多患者血清进一步识别，从而更准确评估以氨基酸出现频率和（或）抗原性质为参数预测表位中关键氨基酸的准确率和效率。突变表位肽与IgE结合存在异质性可能与一些单点关键氨基酸并不属于IgE与Jug r 1表位肽的接触位点有关，这些单点氨基酸可能对表位的立体化学环境产生空间体积效应[35]，这需要使用具有不同空间容积的氨基酸替代进一步研究IgE结合表位中的关键氨基酸。

4 结 论

核桃作为树坚果，对其线性表位的关键氨基酸尚未得到深入的研究。本研究采用2 种免疫信息学方法快速预测抗原表位，比较了2 种方法的预测准确性，发现免疫信息学预测的方法一定程度上可降低突变肽合成时间、经济成本，但可能遗漏一些关键氨基酸，因此丙氨酸扫描诱变法是识别表位中关键氨基酸的准确方法。本研究采用丙氨酸扫描诱变通过部分中国核桃过敏患者血清，识别了核桃主要过敏原Jug r 1的B细胞线性表位中的关键氨基酸，分别为表位1（4LVALLFVANAAA15）中的第4位亮氨酸、第7位亮氨酸、第8位亮氨酸，表位2（16FRTTITTMEIDEDID30）中的第20位异亮氨酸、第21位苏氨酸、第22位异亮氨酸，表位3（125CGISSQRCEIRRSWF139）中的第127位异亮氨酸、第129位丝氨酸、第130位谷氨酰胺。本研究丰富了对核桃等坚果过敏原的认识，为预防和治疗核桃过敏以及在食品加工过程中消除等位基因提供参考。